类型

血清

实验名称

蛋白电泳,serum protein electrophoresis(SPE)

关联实验

白蛋白;总蛋白;抗体检测试验;

关联问题

实验理由

何时实验

患者准备

采样

采样原则

血清中各种蛋白质都有其特有的等电点，各种蛋白质在各自的等电点时呈电中性状态，它的分子所带正电荷与所带负电荷量相等。将蛋白质置于pH比值等电点较高的缓冲液中，它们将形成带负电荷的质点，在电场中均向正极泳动。由于血清蛋白质的等电点不同，带电荷的量多少差异，蛋白质分子量大小也不同，所以在同一电场中泳动速度也不同。蛋白质分子越小带电越多，移动速度越快；分子越大而带电越少，移动速度越慢。按其泳动速度可以分出以下的主要区带，从正极端起，依次为白蛋白、α1球蛋白和α2球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白5条区带。

正常值描述

醋酸纤维法:白蛋白0.62～0.71（62%～71%）；α1球蛋白0.03～0.04（3%～4%）；α2球蛋白0.06～0.10（6%～10%）；β球蛋白0.07～0.11（7%～11%）；γ球蛋白0.09～0.18（9%～18%）

疾病相关

多发性骨髓瘤; 肝癌; 肝昏迷; 肝硬化; 高脂血症; 黄疸; 肾病综合征; 糖尿病; 原发性肝癌; 脂肪肝

摘要

(1)将缓冲液加入电泳槽内，调节两侧槽内的缓冲液，使其处于同一平面。 (2)醋酸纤维素薄膜的准备：取醋酸纤维素薄膜(2cm×8cm)在毛面的一端(负极侧)1.5cm处用铅笔轻划一横线，做点样标记。编号，并标明正、负极后，将薄膜置于巴比妥-巴比妥钠缓冲液中浸泡，待充分浸透后(一般为20min)取出，夹于洁净滤纸中间吸去多余的缓冲液。 (3)将醋酸纤维素薄膜毛面向上贴于电泳槽支架上拉直。用微量吸管吸取无溶血血清3～5μl于横线处沿横线加样，样品应与薄膜的边缘保持一定的距离，以免电泳图谱中的蛋白区带变形，待血清渗入薄膜后，反转薄膜，使光面朝上，平直地贴于电泳槽支架上，用双层滤纸或四层纱布将薄膜的两端与缓冲液连通，稍待片刻。 (4)接通电源，注意醋酸纤维素薄膜上的正、负极，切勿接错。电压90～150v，电流0.4～0.6mA/cm(不同的电泳仪所需电压，电流可能不同，应灵活掌握)，夏季通电45min，冬季通电时间稍长，约为60min，电泳区带展开约25～35mm即可。 (5)染色：通电完毕，取下薄膜直接浸于丽春红S染液或氨基黑10B染色液中，染色5～10min(以白蛋白区带染透为止)，然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。 (6)定量： ①比色法：将漂洗的薄膜吸干，剪下各染色的蛋白区带入相应的试管中，在白蛋白管中加0.4mol/L氢氧化钠6ml(计算时吸光度乘以2)，其余各管加3ml，振摇数次，置37℃水箱20min使其色泽浸出。氨基黑10B染色用分光光度计在620nm处读取各管吸光度，然后计算出各管的含量(同时做空白管对照)。 丽春红S染色时浸出液用0.1mol/L氢氧化钠，加入量同上法。10min后，白蛋白管内加400ml/L醋酸0.6ml(计算吸光度时乘以2)，其余各管加0.3ml，以中和部分氢氧化钠，使色泽加深，必要时离心，取上清液用分光光度计在520nm处读取各管的吸光度(同时作空白对照)，然后计算各自的含量。 ②光密度计扫描法：A.透明：吸去薄膜上的漂洗液(为防止透明液被稀释影响透明结果)，将薄膜浸入透明液中2～3min，然后取出，以滚动的方式平贴于洁净无划痕的载物玻璃片上(切勿产生气泡)，将此玻片竖立片刻，除去多余透明液后，置于恒温90℃至100℃的烘箱内，烘烤10～15min，取出冷却至室温，用此法透明的各蛋白区带鲜明，薄膜平整，可供直接扫描和永久保存(用氢萘或液体石蜡透明，应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明，此法透明的薄膜不能存久，且易发生皱折)。B.扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内，进行扫描分析。

说明

(1)白蛋白减少：见于慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。 (2)α1球蛋白(糖蛋白)增高：见于原发性肝癌。在重型肝炎、肝硬化、肝昏迷时则减少，与白蛋白呈正相关。肝病时测定α1球蛋白对判断肝炎的严重程度和预后有参考价值。一般情况下，α1球蛋白增加示病情较轻，α1球蛋白减少则提示病情较重，在严重肝功能衰竭时，其血清含量可显著降低。 (3)α2球蛋白：病毒性肝炎初期无明显变化，一周后逐渐增加，亚急性肝炎和急性肝坏死、失代偿期肝硬化则减少。 (4)β球蛋白增高：见于脂肪肝、高脂血症、肾病综合征、糖尿病合并高胆固醇血症、梗阻性黄疸、恶性肿瘤。在胆汁淤积性肝病时其含量升高，与α2球蛋白升高相平行。降低于见于急、慢性肝炎，肝硬化，尤以失代偿期肝硬化和坏死肝硬化下降最为显著。 (5)γ球蛋白增高：见于慢性肝炎、肝硬化、肝胆疾患。典型肝硬化尚可见β和γ带相融合，形成β-γ桥。肝病患者γ球蛋白的变化可反映病情的严重程度。随病情好转，其含量可逐渐降至正常，如一直在高水平持续不降，提示病情严重，预后不良，并有向慢性肝炎及肝硬化发展的趋势。此外，感染、血吸虫病、多发性骨髓瘤、结缔组织病等也可升高。降低见于丙种球蛋白缺乏症、部分化疗患者等。 另外，多发性骨髓瘤在β球蛋白区带与γ球蛋白区带之间常出现M球蛋白带；双白蛋白血症可见双条白蛋白区带。

结论有效原因

(1)每次电泳时应交换电极，可使两侧电泳槽内缓冲液的正、负离子相互交换，从而使缓冲液保持在一定的pH水平，然而，每次电泳时薄膜数量不同，故缓冲液在使用10次后，最好弃去，重新配制，否则影响电泳效果。 (2)电泳槽内缓冲液高度保持一定，过低会出γ球蛋白的电渗现象(向阴极移动)。同时，电泳槽两侧液面应保持水平一致，否则通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。 (3)电泳失败的原因： ①电泳图谱不整齐：常见于点样不均匀，位置不佳，薄膜尚未干燥或水分蒸发，缓冲液变质，电泳时薄膜位置放置不正确，使电流方向不平行等。 ②蛋白组分分离不佳：如点样过多，电流过低，薄膜结构过分细致，透水性差，导电差等。 ③白蛋白结果偏低：见于染色时间不足，染色液陈旧，不透明直接扫描等。 ④薄膜透明不完全：见于温度未达到90℃以上将标本放入烘箱，透明液时间过长或薄膜的浸泡时间不足等。 ⑤透明膜上有气泡：见于玻璃片不干净(油脂、污垢等)使薄膜部分与其脱开，贴膜时操作不慎将气泡裹入等。 (4)点加样本时，一定要注意薄膜的毛面和光面，将样本点在毛面上。 (5)放置薄膜时，要注意其正、负极，切勿接错。