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泪液表皮生长因子
采样原则
ELISA的原理是基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应的结果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
摘要
ELISA为多反应、多试剂、多步骤的检验方法，必须严格按照要求细心谨慎操作，否则得不到准确的结果。用于检测不同项目的ELISA操作虽略有差别，但均包括加样、保温、洗涤、比色等步骤，以下叙述各步骤的操作要点。 (1)试剂准备：按试剂盒说明书要求，稀释或配制试验中需要的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜和高质量的。自配的缓冲液应该用pH计测量。从冰箱取出的试验用试剂温度应达到室温后使用。在用HRP作为标记物的试验中，不可用被金属污染的容器。 (2)加样：按要求准备包被好的ELISA板。血清(或体液)标本应该是新鲜采集的或在冰箱中妥善保存的，高度溶血或混浊的标本不宜使用。含叠氮钠作为防腐剂的标本不可用于HRP标记的一步法ELISA。加样时应将标本加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可出现气泡。定量测定中加样量的准确度应达到定量要求。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，并保持正确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。加酶结合物和加底物的操作和要求与加标本相同。 (3)保温：在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后。此时反应的温度和时间应按规定力求准确。保温容器最好是水浴，ELISA板底应贴着水中，使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖。也可将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该预温至规定的温度，如用保温箱保温，空湿盒的预温更为重要。 (4)洗涤：洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在洗涤液中加入吐温一类物质可提高洗涤的效果。洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。 ELISA板的洗涤一般采用以下方法：①吸干反应液；②将洗涤液注满板孔；③放置2min，略作摇动；④吸干或倾去孔内液后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。也可使用板式ELISA自动洗涤仪，但应该先检查仪器的实际使用效果。洗涤仪的每枝吸液管必须同样贴近相应孔的底部，以保证各孔的洗涤效果相同。 (5)显色和比色：在定量测定中加入底物后反应的温度和时间仍应按规定力求准确。但在定性测定中反应一般可在室温中进行。如底物为OPD，应避光放置。反应时间也不需严格控制，有时可根据阳性对照和阴性对照的呈色情况而及时加终止液。为确保各孔的反应时间相同。加终止液的程序和速度应与加底物液时一致。 定性测定如阴性反应呈色浅淡，有时可用目视判断结果。板式ELISA一般均用酶标测读仪在规定的波长测读吸光度。自动酶标测读仪使用前应先测试与所用ELISA板各孔的匹配性和结果的重复性。 比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔(未经任何反应仅加底物的孔)和空白孔(以生理盐水或PBS代替标本作全过程测量的孔)，以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔校零点，测读标本孔，标准品孔和控制品孔的吸光度。如仍以蒸馏水校零点，在计算时需将以上各孔的吸光度减去空白孔的吸光度。
说明
EGF可促进角膜碱烧伤后角膜上皮的再生，但不能阻止角膜上皮反复剥落继发角膜上皮的糜烂。用于治疗近视的准分子激光屈光性角膜切削术(PRK)及放射状角膜切开术后泪液。EGF含量明显升高，并逐渐恢复为正常，推测其原因是升高的泪液EGF促进角膜伤口的愈合。
结论有效原因
ELISA中的主要试剂成份如抗原、抗体、酶结合物、底物等，如制备不当或保存不妥，均易变质失活。ELISA的步骤多，操作如不合规范，难于得到准确的结果。因此为保证检测的有效性，每次试验必须进行质量控制。优良的试剂盒中提供的阳性对照和阴性对照一般可作为试验的质控品，按其说明操作，从所得的吸光度值可以判断试验的有效性。以临床检验中最常用的HBsAg检测为例，试剂盒中的阴性对照应为HBsAg阴性的人血清，阳性对照应标明HBsAg含量(例如9±2ng/ml)。每批试验应同时作3份阴性对照和二份阳性对照。阴性对照测定所得吸光度值应小于某一数值(例如0.100)，而阳性对照吸光度均值减去阴性对照吸光度均值应大干某一数值(例如0.200)。这些数值为该试剂盒在规定的测定条件下，特定的实验值。因此如测定结果符合要求，既表明所用试剂的有效性，又表明操作的正确性，只有在这种情况下，该批试验方为有效。 有的试剂盒中所含阳性对照和阴性对照不符合作为质控品的要求，或实验室的测定条件如比色计等，与试剂盒说明中的不同，则应根据实际情况采用合适的质控品和从实验得出的本实验室的质控值。商品的质控血清价格昂贵。定性测定ELISA的质控品一般可自行制备。仍以HBsAg检测为例。阴性对照可取自用高质量试剂检测为HBsAg阴性的献血员。阳性对照的制备可在阴性对照血清中加入适量的HBsAg阳性血清，将此混合血清与参照标准品或定量质控品作对比测定，标定其HBsAg含量。然后进行适当的稀释，得到所需浓度的HBsAg阳性血清，再加入适量抗菌防腐剂如庆大霉素和柳硫汞后，分装低温冻存。