类型

血清

实验名称

粒细胞集落刺激因子,

关联实验

关联问题

实验理由

何时实验

患者准备

采样

采样原则

ELISA的测定方法可归为夹心法、间接法和竞争法三大类。下面介绍用夹心法检测血清和细胞悬液中的集落刺激因子。

正常值描述

酶免疫分析法(EIA)：阴性。

疾病相关

白血病样反应; 病毒性脑炎; 感冒; 急性早幼粒细胞白血病; 慢性粒细胞白血病; 尿路感染; 新生儿败血症; 再生障碍性贫血; 再障; 中性粒细胞减少症

摘要

(1)包被：将特异性抗体用0.1mol/L碳酸盐溶液(pH9.5)稀释成最佳浓度，每孔加100μl，2～8℃温育过夜。(2)用洗涤液洗3次。 (3)每孔加250μl含4% BSA的0.01mol/L PBS(pH7.3)，37℃温育2h。 (4)弃去PBS，每孔加100μl稀释好的标准品和标本，37℃温育1h。 (5)用洗涤液洗3次。 (6)每孔加100μl稀释好的第二抗体，37℃温育1h。 (7)用洗涤液洗3次。 (8)每孔加100μl稀释好的过氧化物-抗生物素复合物，37℃孵育15min。 (9)用洗涤液洗3次。 (10)每孔加稀释好的TMB底物溶液100μl，37℃温育10～15min。 (11)每孔加1mol/L硫酸溶液100μl终止反应。 (12)置酶标仪在450nm下测光密度(30min内完成)。 (13)根据标准品的数据绘制一标准曲线，然后将标本的平均测定数套入标准曲线，从而得出标本的实际数据。

说明

(1)CSFs测定在血液系统疾病中的意义：较早发现粒细胞减少症及严重再生障碍性贫血骨髓移植后，前5天内的病人尿中可测出CSFs活性。同时这种CSFs产生可能是由于机体免疫系统活化，尤其是与CSFs产生细胞活化有关。CSFs检测对血液系统疾病发病机制、诊断、疗效观察有一定意义。 ①CSFs检测与再生障碍性贫血：再生障碍性贫血尤其是重型再障(SAA)其血清GM-CSF、EPO、G-CSF、粒-单核细胞集落刺激活性及血清体外红系爆式集落刺激活性(BPA)，平均水平均高于正常对照组。有报道用麒麟公司提供的G-CSF试剂盒(ELISA法)，测定10名健康献血员血清G-CSF水平，其参考值为＜78.1ng/L，36例SAA患者中血清G-CSF水平在正常参考组共9例(25%)，G-CSF水平增高组27例(75%)，SAA增高组G-CSF平均值为748.7ng/L(82～5000ng/L)。G-CSF还可作为SAA治疗效果判断的一项指标，一般认为血清G-CSF水平增高的SAA患者其疗效及预后较差。G-CSF的水平在SAA治疗过程中也呈动态变化，随着病情的好转，其血清G-CSF水平逐渐降至正常水平。SAA患者血清EPO水平(ELISA法)也明显高于正常对照组(38.1±38.6U/L)，其平均水平为3318.1±2282.8U/L)。在SAA治疗过程中，EPO水平降低，说明治疗有效。有资料表明EPO水平在再障治疗过程中不降低，反而升高，预示该治疗方案效果不佳，这方面的工作还有待更多的研究来证实。 ②CSFs检测与白血病：CSFs异常可能与肿瘤有关，在造血细胞株的研究中发现经过基因转染而连续表达CSFs，可能导致肿瘤，这些是否有因果关系，值得探讨。但有现象表明：骨髓白血病中有CSFs的产生，白血病病人的原始细胞中GM-CSF、G-CSF表达基因增加。王晓光报道急性白血病AML和ALL病人血清G-CSF(ELISA法)检测阳性率35.7%，而健康对照组血清G-CSF均为阴性；在慢性粒细胞白血病(CML)血清G-CSF的阳性率为25%，他提出的参考值为＜34ng/L，而白血病AML/ALL血清G-CSF在34～180ng/L范围里，呈增高的趋势。 在急性早幼粒细胞白血病(APL)用全反式维甲酸(ATRA)治疗过程中，用ELISA法检测其血清、骨髓单个核细胞及NB4细胞用ATRA诱导前后上清液及冻融物中G-CSF水平，结果治疗前血清G-CSF检出率为20.8%，治疗后检出率升高，在白细胞达到高峰前其阳性率最高，而后逐步下降，上清液及冻融物中G-CSF均未能检出，说明G-CSF、在APL患者用ATRA治疗过程中白细胞升高的发生机制中起一定作用，APL细胞不分泌G-CSF。 ③CSFs检测与慢性中性粒细胞减少症：慢性粒细胞减少症现在认为可能的机制：A.G-CSF产生缺陷；B.造血细胞对G-CSF的反应缺陷。上海瑞金医院报道用ELISA法检测33例慢性中性粒细胞减少症，对照组50例血清G-CSF均＜60ng/L，G-CSF检出阳性率为57.58%，其血清水平为242.26±54.32ng/L。这种G-CSF血清水平的升高，认为A.粒细胞减少后通过反馈调节促使内皮细胞和成纤维细胞上调，使G-CSF产生增加；B.缺乏足够数量的效应细胞而导致与G-CSF结合下降；C.细胞内信号传递旁路的缺陷；D.这种病人易发生细菌感染，导致产生更多G-CSF。 (2)CSFs检测在感染性疾病中的意义：G-CSF作为细菌感染性疾病的早期诊断指标逐步被人们认识，用ELISA法检测各种细菌感染性疾病，大多数表现出G-CSF水平或检出阳性率的增高。如肺炎、心内膜炎、急性尿路感染、手术感染患者、新生儿败血症等疾病中血清G-CSF、水平增高显著，常表现为正常参考值的2～3倍，阑尾炎、发热、胸膜炎、胰腺炎、胆囊炎、肾功能衰竭等患者血清中有不同程度的G-CSF升高，随着这些细菌性感染疾病的恢复，血清G-CSF水平恢复正常。 类白血病样反应患者以血清GM-CSF升高为主，水平为112ng/L，正常参考值为＜2ng/L(日本报道)，而G-CSF增高不显著。美国文献报道在孕妇妊娠过程中感染发生，也常表现出羊水GM-CSF的增加，经治疗后GM-CSF又恢复正常水平。 血清G-CSF水平下降，常见于HIV感染和其他病毒性感染性疾病，如病毒性感冒和病毒性脑炎。 因此，血清G-CSF水平的检测可作为急性细菌感染和病毒感染性疾病的一种有效鉴别诊断指标。 综上所述，CSFs检测的临床意义还有待于进一步探讨，关于各种方法提供的参考值也存在一定的差别，有待于扩大检测范围、统一标准。但血清G-CSF、GM-CSF、EPO、IL-3等水平的检测在血液系统疾病的发生机制、诊断、疗效观察中具有重要意义。特别是G-CSF水平的检测可作为细菌性感染的一种早期、快速、敏感的指标。有资料说明，血清G-CSF测定较急性时相反应蛋白(CRP)更为敏感。因此随着各种CSFs检测方法学的规范化、标准化，CSFs的测定会有更广泛的临床应用前景。

结论有效原因

有的公司提供ELISA的试剂盒第一抗体已经包板，故可省去第一步。在操作过程中要参照说明书操作。