3427 人血小板抗体测定法
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本法系采用血小板与血小板抗体结合后,使血小板发生凝集的原理,通过比较凝集反应终点测定供试品中人血小板抗体效价。
试剂 (1)5%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝剂 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)0.365g、磷酸二氢钾0.875g、氯化钠2.125g、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2?2H2O)12.5g,加水溶解并稀释至250ml。
(2)0.33%EDTA溶液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)0.73g、磷酸二氢钾1.75g、氯化钠4.25g、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2?2H2O)1.65g、加水溶解并稀释至500ml。
(3)血小板稀释液 取3人份以上AB型血清混合,56℃灭能30分钟,按AB型血清每100ml加硫酸钡50g的比例加入硫酸钡,置37℃吸附1小时,随时搅动,然后以每分钟3000转离心30分钟,弃去沉淀,吸上清液备用。试验当天按1份血清加3份生理氯化钠溶液配成血小板稀释液(注意AB型血清中不得混有红细胞及溶血)。
(4)血小板悬液的制备 采集人静脉血20ml,按5%EDTA溶液与全血以1:9(体积比)的比例混合,于20℃以每分钟800转离心15分钟,取上层血浆加0.33%EDTA溶液至原全血体积,于20℃以每分钟1500转离心10分钟,弃去上清液,如此再重复用0.33%EDTA洗涤2次,弃上清液,向沉淀中加血小板稀释液0.5ml,混匀,计数并将血小板浓度调至2.5×105~3.5×105/mm3即可(注意:计数时血小板悬液应在计数板上静置2~3分钟,并在10分钟内计数完)。
供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品做2倍系列稀释至1:16。
阳性对照溶液的制备 取经人血小板免疫的猪血浆(或兔血清)0.5ml,60℃灭能10分钟,用硫酸钡0.05g于37℃;吸附15分钟后,以每分钟3000转离心20分钟,取上清液备用。
阴性对照溶液的制备 生理氯化钠溶液及血小板稀释液。
测定法 量取不同稀释度供试品溶液各0.1ml,分别加血小板悬液0.1ml,于37℃保温30分钟后,滴到计数板上,静置2~3分钟,在20~40倍显微镜下观察结果。本试验同时设阴性对照、阳性对照组。
(1)阳性对照 取阳性对照溶液0.1ml,自“加血小板悬液0.1ml”起,同法操作。
(2)阴性对照 取阴性对照溶液0.1ml,自“加血小板悬液0.1ml”起,同法操作。
结果判定 阳性对照为“++”;阴性对照为“-”;试验成立。以“+”为判定终点,即以供试品出现“+”的最高稀释度为该供试品的血小板抗体效价。
【附注】 (1)“-”无凝块或偶见2~3个血小板成串。
(2)“+”小凝块,3~5个血小板凝集,游离血小板少。
(3)“++”大凝块,6个以上血小板聚集,几乎无游离血小板.

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