3514 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法,2015药典大全

3514 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法

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四部

分类

通则

内容

本法系依据特异性抗体（免疫球蛋白）Fab段与红细胞上已包被的相应抗原结合，抗体暴露出Fc段补体Clq的结合位点，从而激活后续的补体各成分，最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂，释放出血红蛋白。通过溶血反应动力学曲线，计算人免疫球蛋白激活补体活性的功能指数（I_Fc），以此测定供试品Fc段生物学活性。
试剂（1）PBS（pH7.2）称取无水磷酸氢二钠1.02g、无水磷酸二氢钠0.34g、氯化钠8.77g，加适量水溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH值至7.2，再加水稀释至1000ml。
（2）钙-镁贮备液称取氯化钙1.10g、氯化镁5.08g，加水25ml使溶解。
（3）巴比妥-钙镁贮备液称取氯化钠51.85g、巴比妥钠6.37g，加水1000ml使溶解，加入钙-镁贮备液3.125ml，用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.3，再加水稀释至1250ml。除菌过滤后4℃保存备用。
（4）牛白蛋白-巴比妥缓冲液称取牛血清白蛋白0.15g加入巴比妥-钙镁贮备液20ml中，加水溶解并稀释至100ml。临用前配制。
（5）1.3mg/L鞣酸PBS（pH7.2）溶液
A液称取鞣酸1mg，加PBS（pH7.2）10ml，使溶解。
B液量取A液0.1ml，加PBS（pH7.2）7.5ml，混匀，即得，临用前配制。
（6）10%氯化铬溶液称取氯化铬5g，加生理氯化钠溶液50ml使溶解。4℃保存（可保存半年）。
（7）1%氯化铬溶液取10%氯化铬溶液0.1ml，加生理氯化钠溶液0.9ml，混匀。临用前配制。
敏化红细胞的制备
A液取健康人抗凝的O型血3人份以上混合，用PBS洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量压积红细胞悬浮于1.3mg/L鞣酸PBS（1：40），置37℃水浴中轻摇30分钟后再用PBS洗涤3次，最后用PBS制备成2.5%红细胞悬浮液。
B液用PBS适当稀释的白喉类毒素或腮腺炎病毒与1%氯化铬溶液0.25ml混合（10：1）后，置37℃水浴中轻摇15分钟。
将A液、B液按1：4混合，置37℃水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用PBS将沉淀（敏化红细胞）洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液悬浮红细胞，调节至适宜浓度，使其在波长541nm处的吸光度为1.0±0.1。
参考品溶液的制备用1mol/L氢氧化钠溶液将参考品pH值调节至6.8~7.0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将参考品IgG浓度稀释至每1ml含40mg。
供试品溶液的制备用1mol/L氢氧化钠溶液将供试品pH值调至6.8~7.0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每1ml含40mg。
测定法取供试品溶液0.9ml，加敏化红细胞悬液0.1ml，混匀，置37℃水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液1ml洗涤红细胞，共洗3次。末次离心后弃上清液800μl，向沉淀中加入600ml预热到37℃的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每1ml含150CH₅₀的补体200μl，混匀后立即照紫外-可见分光光度法（通则0401）在波长541nm处测定起始吸光度（A_s），之后，每隔1分钟测定1次，即得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止测量。分别取参考品及阴性对照（牛白蛋白-巴比妥缓冲液）0.9ml，自“加敏化红细胞悬液0.1ml”起，同法操作。按公式（1）分别计算出参考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式（2）计算供试品激活补体的功能指数（I_Fc），应不低于国家参考品活性的60%。

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