3531 尼妥珠单抗生物学活性测定法,2015药典大全

3531 尼妥珠单抗生物学活性测定法

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四部

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通则

内容

一、H292细胞增殖抑制法
本法系依据人肺癌淋巴结转移细胞（H292）在不同浓度尼妥珠单抗注射液作用下生长情况不同，检测尼妥珠单抗注射液的生物学活性。
试剂（1）RPMI1640培养液取RPMI1640培养液粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10⁵IU和链霉素10⁵IU，加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。或用商品化的RPMI1640溶液。
（2）维持培养液取胎牛血清（FBS）3ml，加RPMI1640培养液97ml，4℃保存。
（3）完全培养液取胎牛血清（FBS）5ml，加RPMI1640培养液95ml，4℃保存。
（4）磷酸盐缓冲液（PBS）称取氯化钠8.0g，氯化钾0.20g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。或用商品化的PBS溶液。
（5）0.25%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）-胰酶：商品化0.25%EDTA-Na₂-胰酶。
（6）显色液取商品化细胞计数试剂盒（CCK-8）溶液540μl，加维持培养液810μl。
标准溶液的制备无菌条件下，取尼妥珠单抗标准品，用维持培养液稀释至约300μg/ml，用维持培养液做4倍稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。
供试品溶液的制备无菌条件下，用维持培养液将供试品按与尼妥珠单抗标准品相同的稀释比例稀释至300μg/ml（若供试品溶液蛋白质浓度高于标准品时，以半成品配制用缓冲液预稀释至标准品的蛋白质浓度），用维持培养液做4倍稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。
测定法 H292细胞用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵~5.0×10⁵个细胞。弃去培养瓶中的培养液，0.25%EDTA-Na₂-胰酶消化并收集细胞，用完全培养液配成每1ml含有6×10⁴8×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。18~20小时后弃去细胞培养板中的完全培养液，再加入不同浓度标准品溶液或供试品溶液，每孔200μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养68~72小时。每孔加入显色液30μl，混匀，于37℃、5%二氧化碳条件下培养4小时后，放入酶标仪，以630nm作为参比波长，在波长450nm处测定吸光度，记录实验结果。以细胞孔中加入200μl维持培养液作为细胞对照，无细胞孔内加入200μl维持培养液作为空白对照，同法测定，记录实验结果。
采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，以标准品或待测样品浓度为横坐标，以平均吸光度值为纵坐标，计算样品和标准品的半效浓度（ED₅₀），按下式计算结果：

试验有效标准：S形曲线平行假设未被否决（P值>0.05）且曲线拟合度R²应大于0.92。
结果判定供试品生物学活性应不低于标准品的50%。
二、相对结合活性测定法
本法系依据不同浓度尼妥珠单抗注射液与人肺癌H125细胞结合情况不同，用流式细胞术检测尼妥珠单抗注射液相对结合活性。
试剂（1）RPMI1640培养液取RPMI1640培养液粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10⁵IU和链霉10⁵IU，加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。或用商品化的RPMI1640溶液。
（2）细胞培养液取胎牛血清（FBS）10ml，加RPMI1640培养液90ml，4℃保存。
（3）10×磷酸盐缓冲液（PBS）取三水合磷酸氢二钾19.7068g，二水合磷酸二氢钠3.4328g，氯化钠14.4g，超纯水200ml溶解，经121℃、15分钟灭菌。
（4）PBS 取10×PBS100ml，用超纯水稀释至1000ml。
（5）0.25%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）-胰酶
商品化0.25%EDTA-Na₂-胰酶。
（6）10%叠氮钠取叠氮钠0.10g，加1ml超纯水溶解。
（7）稀释液取牛血清白蛋白0.10g，10%叠氮钠100μl，PBS10ml，混匀。
（8）1%多聚甲醛溶液取多聚甲醛5g，1mol/L氢氧化钠溶液250μl，加10×PBS50ml，混匀，用水定容至500ml。
（9）抗人异硫氰酸荧光素（FITC）稀释溶液取抗人FITC抗体溶液适量，用稀释液进行1：20~1：30稀释。
标准品溶液的制备取尼妥珠单抗标准品，用稀释液稀释至50μg/ml、15μg/ml、5.0μg/ml、3.0ug/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.50μg/ml、0.20μg/ml和0.05μg/ml，每个稀释度做2孔。
供试品溶液的制备取供试品，用稀释液稀释至15μg/ml、5.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/mg、1.0μg/ml、0.50μg/ml、0.20μg/ml和0.05μg/ml，每个稀释度做2孔。
测定法 H125细胞用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵~5.0×10⁵个细胞。弃去培养瓶中的培养，0.25%EDTA-Na₂-胰酶消化后，于4℃每分钟1100转离心5分钟，弃去上清液，收集细胞并计数，细胞活力（活细胞数占细胞总数的百分比）应不小于80%。用10mlPBS洗涤细胞2次后，用PBS配成每1ml含有1×10⁷个细胞的细胞悬液。取适宜规格离心管数支，向各离心管加入20μl不同浓度标准品或供试品溶液，各个浓度做2个复孔，其中2管加入20μl稀释液作为空白对照。向含有不同浓度的标准品溶液、供试品溶液和空白对照溶液的离心管中加入25μl细胞悬液，混匀，4℃下保温30分钟。向每个离心管中加入700μlPBS，于4℃每分钟1100转离心5分钟。小心弃去上清液，在旋涡振荡器上轻轻振荡。向每个离心管中加入20μl抗人FITC稀释溶液，混匀。4℃下保温30分钟。向每个离心管中加入700μlPBS，于每分钟1100转离心5分钟，小心弃去上清液，在旋涡振荡器上轻轻振荡。向每个管中加入1%多聚甲醛溶液500μl。用流式细胞仪读取细胞平均荧光强度，记录测定结果。
采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，以标准品或待测样品浓度为横坐标，以平均荧光强度为纵坐标，计算样品和标准品的半效浓度（ED₅₀），按下式计算结果：

试验有效标准：S形曲线平等于假设未被否决（P值＞0.05）且曲线拟合度R²应大于0.97。
结果判定供试品相对结合活性应不低于标准品的60%。

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