内容
【摘要】 【目的】从众多的树脂型号中筛选出分离纯化黄连总生物碱效果较好的一种。【方法】运用ab8、hp20、ld605、ads3、ads5、d151、da201、xad7、nka9 9种树脂，以黄连总生物碱的吸附率和解吸率为指标进行初筛，并以盐酸小檗碱的解吸率为指标，进一步的筛选。【结果】 9种树脂中，ads3树脂的吸附和解吸能力均较强，总生物碱的吸附率达到9726%，解吸率达到8482%。盐酸小檗碱的解吸量达到9311 mg。【结论】ads3树脂对总生物碱及盐酸小檗碱的吸附和解吸性能都较好，可用于黄连总生物碱的分离纯化。
【关键词】 黄连/分离和提纯;总生物碱/分析;盐酸小檗碱/分析;大孔树脂
黄连是毛莨科植物黄连的根茎，有效成分主要是生物碱，其中小檗碱的含量最高，可达10%左右，而且以盐酸盐的状态存在于黄连中[1]。黄连中的生物碱大多是季铵型生物碱，在水中溶解度大，有一定的极性[1]。在运用大孔树脂分离纯化中药有效成分时，树脂的极性和所含的官能团对化合物的吸附能力有很大的影响。因此，对于中药有效成分或有效部位的纯化，树脂型号的选择非常重要。
根据已有的报道，目前常用于生物碱分离纯化的树脂型号有da201、nka9、d101、ld605、ab8、d151、xad4、xad7、ads3、ads5、hp20[2~7]。其中，d101、hp20、xad4实为同一种树脂。wWw.11665.coM故本研究将从da201、nka9、ld605、ab8、d151、xad7、ads3、ads5、hp20 9种树脂中筛选一种分离效果较好的型号，现报道如下。
1仪器与材料
lc10at vp plus 高效液相色谱仪(日本岛津)，spd10a vp plus 紫外—可见检测器，紫外—可见分光光度计(thermo electron corporation)，uvmini1240紫外分光光度计。ab8、hp20、ld605、ads3、ads5、d151均由天津欧瑞生物科技有限公司提供，da201、nka9由沧州宝恩化工有限公司提供，xad7由美国哈门罗斯公司提供，黄连药材由北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司提供(经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波老师鉴定为毛莨科植物黄连coptis chinensis franch的干燥根茎)，盐酸小檗碱标准品(批号：110713200609)由中国药品生物制品检定所提供。
2方法与结果
21黄连提取液中总生物碱的测定
211标准曲线的绘制
2111检测波长的确定分别吸取盐酸小檗碱标准品溶液和经适当稀释后的黄连提取液，在200～600 nm之间进行波长扫描，两者在347 nm波长处呈现共有吸收峰，故确定检测波长为347 nm。见图1。
2112标准曲线的绘制精密称取干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品1110 mg，置50 ml量瓶中，用005 mol/l h2so4溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取盐酸小檗碱对照品溶液02、05、08、10、15、20 ml，分别置50 ml量瓶中，加005 mol/l h2so4稀释至刻度，摇匀，在347 nm波长处测定吸光度。以吸光度x为横坐标，质量浓度y为纵坐标，进行线性回归。结果表明在000176～1176 mg/ml范围内盐酸小檗碱的浓度与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程为：y=0016 2x-0000 04，r=0999 9。
2010年第27卷广州中医药大学学报212黄连提取液中总生物碱的测定称取黄连药材10 g，加8倍量体积分数60%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液。将提取液移至1 000 ml的容量瓶中，加体积分数60%乙醇定容至刻度。取1 ml样品，置25 ml量瓶中，加005 mol/l h2so4定容至刻度。取25 ml上述样品，置25 ml量瓶中，加005 mol/l h2so4定容至刻度。在347 nm处测吸光度为0297。采用此法提取得到的总生物碱为0119 g/g药材。
22大孔树脂型号的初筛
221供试品溶液的制备取黄连粉末100 g，加8倍量的体积分数60%的乙醇，加热回流提取3次，每次1 h，合并3次提取液，过滤。滤液减压真空浓缩至无醇味。将提取液转移至1 000 ml的容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，备用。取1 ml上述提取液，置于25 ml的容量瓶中，用005 mol/l的h2so4定容至刻度。取上述稀释液25 ml，置于25 ml的容量瓶中，用005 mol/l h2so4定容至刻度。在347 nm波长下测得吸光度为0285。计算得提取液中总生物碱的浓度为1144 mg/ml。
222树脂的预处理根据黄连中生物碱的性质，综合已有的文献报道[2～7]，从众多的树脂型号中选取了9种作为研究对象，各种树脂的性能参数和预处理方法见表1。
223 静态吸附和解析试验准确称取上述各种湿树脂2 g，分别装入100 ml的三角瓶中，加入20 ml的黄连提取液，将上述样品放入摇床，在100次/min的振速下振荡吸附24 h。将吸附后的黄连提取液真空抽滤。取滤液1 ml，加005 mol/l的h2so4定容至25 ml，测其吸光度。各种树脂吸附后的吸光度见表1。将真空抽滤后的湿树脂倒回100 ml的三角瓶中，加入40 ml体积分数95%乙醇，振荡解吸24 h，振荡速度为100次/min。将解吸后的药液真空抽滤。取滤液1 ml，加005 mol/l h2so4定容至25 ml。取上述稀释液25 ml，加005 mol/l h2so4定容至25 ml，测其吸光度。各种树脂的吸附率和解吸率按以下公式计算，结果见表1：总生物碱的吸附量 = (原料液中总生物碱的浓度-吸附后药液中总生物碱的浓度)×20 ml;总生物碱的吸附率 = 吸附量 / 加入的提取液中总生物碱的量;总生物碱的解吸量 = 解吸液中总生物碱的浓度×40 ml;总生物碱的解吸率 = 解吸量 / 吸附量。表1结果显示：ab8、ads3、ads5、hp20、 ld605 5种树脂的吸附性能较好，但ab8、ads5的解吸效果不如另外3种，hp20、ld605、ads3 3种树脂的吸附和解吸效果都较好。故将作为后续研究对象，从3种树脂中精选1种最佳的树脂。表1不同型号的树脂初筛试验结果 23树脂的精选
231黄连提取液中盐酸小檗碱的含量测定
2311标准曲线的制备采用diamonsil 5 μm c18柱(250 mm×46 mm);流动相为乙腈1 g/l磷酸(体积比为50∶50)，内含1 g/l 十二烷基磺酸钠;流速：1 ml/min;检测波长：347 nm。
准确称取111834 mg的盐酸小檗碱标准品，用乙腈1 g/l磷酸(体积比为50∶50)定容至10 ml，取上述溶液1 ml，用乙腈1g/l磷酸(体积比为50∶50)定容至5 ml，则盐酸小檗碱的浓度为02237 mg/ ml。分别进样2、4、8、12、16 μl的上述标准溶液，对应的盐酸小檗碱的质量为0447、0895、1789、2684、3579 μg。以峰面积y为纵坐标，盐酸小檗碱的质量x为横坐标作图，得标准曲线为：y= 3×106x+229 809,r=0999。结果见图2。张英，等.大孔树脂分离纯化黄连总生物碱型号的筛选第1期图2进样量为12 μl的标准溶液色谱图
figure 2the chromatogram of standard solution with 12μl injection volume2312黄连提取液中盐酸小檗碱的含量测定取黄连提取液，进样5 μl，根据标准曲线计算盐酸小檗碱的量为2372 μg。结果见图3。图3黄连提取液的色谱图
figure 3the chromatogram of extraction liquid from rhizoma coptidis232静态吸附和解析实验准确称取上述3种湿树脂2 g，分别装入100 ml的三角瓶中，加入20 ml的黄连提取液，其中含有的总生物碱的质量以盐酸小檗碱计为2288 mg，盐酸小檗碱的质量为9488 mg。将上述样品放入摇床，在100次/min的振速下振荡吸附24 h。将吸附后的黄连提取液真空抽滤。取滤液1 ml，加005 mol/l的h2so4定容至25 ml，测其吸光度。
将真空抽滤后的湿树脂倒回100 ml的三角瓶中，加入40 ml体积分数95%的乙醇，振荡解吸24 h，振荡速度为100次/min。将解吸后的药液真空抽滤。取滤液1 ml，加005 mol/l的h2so4定容至25 ml。取上述稀释液25 ml，加005 mol/l的h2so4定容至25 ml，测其吸光度。分别取上述3种树脂的解吸液，进样10μl，测其峰面积。表2结果显示，3种树脂中，ads3树脂对黄连提取液中的总生物碱和盐酸小檗碱的吸附和解吸效果都是最好的。表2各种树脂精选试验结果注：因初筛和精选所用的紫外分光光度计不同，所以前后两次测得的总生物碱的吸附率和解吸率略有不同。
3讨论
通过对9种大孔树脂的初筛，以提取液中总生物碱的吸附率和解吸率为指标，筛选出效果较好的3种:hp20、ld605、ads3。运用该3种树脂，同时以提取液中盐酸小檗碱的解吸率作为考察指标，进行进一步的静态吸附和解吸实验，综合各种指标，研究发现ads3是一种理想的树脂，具有较好的推广应用价值。本实验过程中同时发现，对总生物碱吸附率高的树脂，盐酸小檗碱的吸附效果也较好，分析原因可能是黄连中多数生物碱具有相似的结构和极性，所以对小檗碱和总生物碱的吸附具有一致性。
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