内容
作者：许惠琴，王华富，高钦，蔡宝昌
【摘要】 【目的】观察百合知母汤含药血清对氯化镉(cdcl2)致大鼠卵巢颗粒细胞(gc)损伤的影响。【方法】(1)分别选用23 d、3月和12月龄雌性sd大鼠各5只，取卵巢进行gc计数，连续观察10 d内gc的生长情况，采用噻唑蓝(mtt)比色法于490 nm波长处测定光密度(d)值，筛选最适卵巢gc。(2)于最适卵巢gc体外培养的第3天加入终浓度分别为10、20、40、60、80 μmol/l的cdcl2刺激液，37℃、体积分数5%co2培养箱内培养48 h后，采用mtt法观察细胞生长情况，筛选cdcl2刺激液的最适浓度。(3)将筛选出最适的卵巢gc体外培养 72 h后，在96孔板内分别加入最适浓度的cdcl2刺激液及终浓度分别为体积分数125%、25%、5%、10%、20%的大鼠百合知母汤含药血清，依据含药血清浓度由低至高分为5组，同时另设对照组：①空白对照组：体积分数10%dmem培养液，②模型组：体积分数10%dmem培养液+最适浓度cdcl2刺激液，③空白血清组：空白血清+最适浓度 cdcl2刺激液。继续培养48 h后，采用mtt比色法测定d值，观察百合知母汤含药血清对大鼠卵巢gc以及对cdcl2致卵巢gc损伤后的影响。wWW.11665.cOM【结果】23 d龄大鼠卵巢gc数量多、形态好，呈指数生长，23 d为最适生长时间。cdcl2浓度与卵巢gc的活性呈剂量依赖性关系，随浓度增加而损伤加重，其中浓度为40 μmol/l cdcl2培养液中的gc细胞边缘出现皱缩，为最适cdcl2刺激液浓度。百合知母汤含药血清对卵巢gc生长有促进作用，能抵抗40 μmol/l cdcl2刺激液对gc的损伤作用。【结论】百合知母汤含药血清保护大鼠卵巢gc的作用与其能拮抗cdcl2的损伤和增加卵巢gc的活性和数量有关。
【关键词】 百合知母汤/药理学;围绝经期综合征/中药疗法;血清药理学;细胞培养
百合知母汤出自张仲景《金匮要略》，是临床治疗围绝经期综合征的基本方剂。目前越来越多的研究将围绝经期综合征与妇女卵巢功能衰退和细胞凋亡联系起来，认为卵巢颗粒细胞(gc)凋亡，触发卵泡闭锁，颗粒细胞产生雌激素减少促进了性腺激素受体的减少从而引发本病[1-2]。因此本实验观察了百合知母汤含药血清对体外培养的卵巢gc的影响，以及对氯化镉(cdcl2)致卵巢gc损伤后的作用，现报道如下。
1材料与方法
11实验动物23 d、3月和12月龄清洁级雌性sd大鼠，由扬州大学比较医学动物中心提供,动物合格证号：syxk(苏)20020053。
12药物及试剂百合知母汤(百合与知母质量比为3∶1)，制成含生药量为08 g/ml的浓缩液。dmem为美国gibco公司产品，小牛血清(dbcs)为jrh biosciences公司产品。噻唑蓝(mtt)由ultra pure grade, amresco分装，临用前用磷酸盐缓冲液(pbs)配制成50 mg/l mtt溶液，于4℃冰箱保存。二甲基亚砜(dmso)为上海久亿化学试剂有限公司产品。注射用血促性素(pmsg)为宁波市三生药业有限公司产品(批号：070909)，pbs(ph=70)为福州迈新公司产品(1小袋溶解在2 l蒸馏水中)，cdcl2由亭新化工试剂厂生产。
13仪器ja 2003型电子秤为上海天平仪器厂产品，spectra max 190酶标仪为美国molecular devices公司产品，napco co2 incubator购自precision scientific公司，xszd2倒置生物显微镜为重庆光学仪器厂产品，swcj1f超净工作台为苏州安泰空气技术有限公司产品，ldz52型全自动离心机为北京医用离心机厂产品，dkb8a型电热恒温水槽为上海精宏实验设备有限公司产品。
14卵巢gc最适生长时间和cdcl2刺激液最适浓度的筛选
2009年第26卷广州中医药大学学报许惠琴，等.百合知母汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞的保护作用第6期141卵巢gc最适生长时间取23 d、3月和12月龄雌性sd大鼠各5只(其中23 d龄大鼠提前48 h皮下注射pmsg，66 u/只)，脱颈椎处死后，放入盛有体积分数75%酒精的玻璃缸内浸泡10 min。在无菌条件下，取出卵巢，剪破卵泡，200目尼龙膜过滤，取900 μl细胞悬液，用04 mg/l台盼蓝溶液100 μl染色，计数活细胞数(拒染)及死细胞数，并观察细胞活率。将3瓶细胞密度分别调至1×106个/ml，每孔加80 μl细胞混悬液，12个复孔，共10板，放入37℃、体积分数5%co2培养箱内培养。每隔24 h抽取1板加5 mg/l mtt 20 μl，4 h后加dmso 150 μl，振荡10 min，于490 nm波长处测定光密度(d)值，连续观察10 d内不同时期gc的生长情况，筛选出最适卵巢gc。未测板每隔3 d更换50 μl培养液，继续培养、测定。
142cdcl2刺激液最适浓度取最适卵巢gc，将细胞密度调至1×106个/ml后均匀接种于96孔培养板中，6个复孔，放入37℃、体积分数5%co2培养箱内培养，第3 d时分别加入终浓度为10、20、40、60、80 μmol/l的cdcl2刺激液，空白对照组含cdcl2 0 μmol/l。继续培养48 h后，采用mtt法观察细胞生长情况，筛选出最适cdcl2刺激液浓度。
15含药血清的制备选取成年期雌性sd大鼠10只，随机分为2组，每组5只。百合知母汤组每次灌胃百合知母汤8 g/kg，每天2次，空白对照组每次灌胃等容积生理盐水。连续给药3 d后禁食12 h，于第4天一次性给予全天剂量，1 h后颈总动脉取血，离心后分离血清，56℃水浴灭活30 min，过滤除菌。
16百合知母汤含药血清对大鼠卵巢gc的影响取最适卵巢gc，将细胞密度调至1×106个/ml后均匀接种于96孔培养板中， 6个复孔，放入37℃、体积分数5%co2培养箱内培养，预培养72 h后，换液并加入含药血清，依据含药血清浓度由低至高分为5组，使其终浓度分别为体积分数125%、25%、5%、10%、20%。另设对照组：①空白对照组：体积分数10%dmem培养液，②空白血清组。继续培养48 h后，采用mtt比色法d值，观察含药血清对大鼠卵巢gc的影响。
17百合知母汤含药血清对cdcl2致gc损伤的影响取最适卵巢gc，将细胞密度调至1×106个/ml后均匀接种于96孔培养板中， 6个复孔，放入37℃、体积分数5%co2培养箱内培养，预培养72 h后，换液并加入最适浓度的cdcl2刺激液，依据含药血清浓度由低至高分为5组，使其终浓度为体积分数125%、25%、5%、10%、20%。另设对照组：①空白对照组：体积分数10%dmem培养液。②模型组：体积分数10%dmem培养液+最适浓度 cdcl2刺激液。③空白血清组：空白血清+最适浓度 cdcl2刺激液。继续培养48h后，采用mtt比色法测定d值，观察含药血清对cdcl2刺激液致gc损伤的影响。
18统计学方法采用微软excel软件进行数据的分析。 2结果
21卵巢gc最适生长时间的确定图1结果显示，23 d幼年期大鼠卵巢gc数量多、形态好，在培养3~8 d内呈指数生长，为最适的生长时间。3月龄成年期大鼠卵巢gc数量和形态都不如幼年期大鼠的gc，且其指数生长期较短。12月龄老年期大鼠卵巢gc数量较少，活性低，培养5 d后已基本无细胞增殖。因此，本实验选择幼年期大鼠卵巢gc进行药物的筛选，并且选择在培养第3天时介入干扰因素，第4天测定细胞活性。
22cdcl2刺激液最适浓度的确定相差显微镜下观察到20 μmol/l以上浓度的cdcl2对gc有损伤作用。40 μmol/l cdcl2培养的gc细胞边缘出现皱缩，少量细胞悬浮于培养液中。60、80 μmol/l cdcl2培养的gc中多数细胞边缘出现皱缩，并有大量细胞脱壁死亡。表1结果显示，随cdcl2浓度的增加，d值降低，提示其呈剂量依赖性关系，随浓度增加而损伤加重。因此，我们选择40 μmol/l cdcl2作为最适的刺激浓度。表1不同浓度cdcl2对颗粒细胞增殖的影响
23百合知母汤含药血清对大鼠卵巢gc的影响表2结果显示，空白血清组和空白对照组比较差异有显著性意义(p 001)，说明大鼠血清对卵巢gc生长有促进作用。各含药血清组gc数目都有所提高，其中体积分数5%、10%含药血清组gc数目显著增多，与空白血清组比较差异有显著性意义(p 005)，说明百合知母汤可能有促进卵巢gc增殖的作用。表2百合知母汤含药血清对大鼠卵巢gc的影响统计方法：t检验;①p 001，与空白对照组比较;②p 005，与空白血清组比较
24百合知母汤含药血清对cdcl2刺激液导致gc损伤的影响表3结果显示,40 μmol/l cdcl2模型组d值减小，与空白对照组比较差异有显著性意义(p 005)，说明cdcl2对gc有损伤作用。空白血清组d值增大，与模型组比较差异有显著性意义(p 001)，说明大鼠血清对卵巢gc生长有促进作用。含药血清各组d值增大，与模型组比较差异有显著性意义(p 005或p 001)，其中体积分数5%、10%含药血清组与空白血清组比较差异有显著性意义(p 005)，说明百合知母汤对cdcl2致gc损伤具有一定的保护作用。表3百合知母汤含药血清对cdcl2刺激液导致gc损伤的保护作用
3讨论
雌激素的产生需要颗粒细胞和卵泡膜细胞两种细胞的作用，雄激素在卵泡膜细胞内形成，由胆固醇合成孕烯醇酮，并转化为雄激素的中间产物无表雄酮和雄甾烯二酮。雄激素由卵泡膜细胞转运至颗粒细胞，被芳香化酶转化为雌激素[3]。因此测定卵巢颗粒细胞的功能对研究围绝经期综合征，探讨药物的作用机制具有十分重要的意义。
细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法之一，确定生长曲线有助于了解细胞的分裂、增殖情况，只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合观察细胞生长变化[4]，而药物的干预也应该在细胞的指数生长期内进行，从而使实验结果更科学、更准确。镉对雌性哺乳动物的生殖系统具有明显的毒害作用，可引起卵巢病理组织学改变，造成卵泡发育障碍，还可以抑制卵巢颗粒细胞和黄体细胞类固醇的生物合成，影响卵巢内分泌功能[5]。大量体外研究实验表明，镉可以通过抑制卵巢类固醇激素的生成和分泌，使颗粒细胞功能显著降低，从而使卵巢颗粒细胞基底雌激素(e2)含量明显减少[6-7]。刁书永等[8]报道，镉对卵巢颗粒细胞的凋亡有促进作用，并有一定的剂量相关性。
本实验结果证实，幼年期大鼠的卵巢gc活性高，指数生长期较长，自身稳定性较好，因此，选择幼年期大鼠卵巢gc进行药物的筛选，并且选择在体外培养第3天时介入干扰因素，48 h后测定细胞活性。卵巢gc在40 μmol/l cdcl2培养液中边缘出现皱缩，部分细胞悬浮死亡，与正常生长细胞比较差异有显著性意义(p 005)。而百合知母汤含药血清能不同程度地增加细胞活性，增加活细胞数量，起到细胞保护作用，提示百合知母汤对围绝经期大鼠卵巢功能的保护作用与其能拮抗cdcl2的损伤和增加卵巢颗粒细胞的活性和数量有关。此外，我们在实验中还发现，大鼠血清对卵巢颗粒细胞的生长有显著的促进作用(p 001)，这可能是由于同种动物的血清较利于细胞生长，而异种动物血清则可能对细胞产生细胞毒作用[9]。对于大鼠gc而言，大鼠血清的同源性显然要优于小牛血清，因此，加入大鼠血清培养后，颗粒细胞的生长较好。
【参考文献】 [1]quirk s m, porter d a, huber s c, et al. potentiation of fasmediated apoptosis of murine granulosa cells by interferongamma, tumor necrosis factoralpha, and cycloheximide[j]. endocrineology, 1998,139(12):4860. [2]张雅萍, 王秀霞, 刘丽. 坤宁安丸对更年期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及其相关基因bcl2和fas表达影响的实验研究[j]. 中国中医药科技, 2001,8(5):94. [3]张绍芬. 绝经——内分泌与临床[m]. 北京：人民卫生出版社, 2005:10-11. [4]司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[m]. 北京：世界图书出版公司,1996：175. [5]安红敏, 郑伟, 高扬. 镉的健康危害及干预治疗研究进展[j]. 环境与健康杂志,2007,24(9): 739 [6]piasek m, laskey j weffects of in vitro cadmium exposure on ovarian steroidogenesis in rats[j]. j appl toxicol, 1999,19(3): 211. [7]paksy k. cadmium interferes with steroid biosynthesis in rat granulosa and luteal cells in vitro[j]. biometals, 1992,5(4):245. [8]刁书永, 袁慧. 镉对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响研究[j]. 畜牧兽医学报, 2005,36(11)：1155. [9]吴健宇, 穆静, 李仪奎. 血清药理实验中异种动物血清对细胞的毒性作用和灭活后的减毒作用[j]. 中国药理学通报，2000,16(1):118.