内容
【摘要】 目的 研究以survivin为靶标的小干扰rna（sirna）与化疗药5fu联合应用抑制mcf7细胞增殖的作用。方法 以脂质体为载体，将survivin sirna转染至mcf7细胞中，用四氮唑盐（mtt）法染色并计算sirna联用5fu对mcf7细胞的抑制率，用sas统计软件及金正均q值法进行统计分析。结果 单用5fu，ic50为4.42μg/ml；加入5nmol/l sirna后，ic50降为1.18μg/ml；sirna与5fu联用的抑制作用较单用5fu强（f=26.74，p＜0.01)；q值分析表明survivin sirna与中低浓度的5fu联用，有较好的协同作用（q≥1.15）。结论 survivin sirna与5fu联用，可显著增强对mcf7细胞增殖的抑制,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。 【关键词】 rna干扰 化学疗法 联合治 mcf7 目前化疗存在两个主要缺点,一是化疗药物对正常细胞的毒性,二是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。本研究通过rna干扰技术靶向抑制调节细胞凋亡的survivin基因的表达，旨在研究survivin sirna诱导乳腺癌细胞mcf7凋亡和提高其对常用抗肿瘤药物敏感性的作用，探讨survivin基因用于肿瘤基因治疗的可能性。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 lipofectaminetm2000购自美国invitrogen公司，四氮唑盐（mts）购自美国promega公司，5氟尿嘧啶（5fu）购自天津人民制药厂（生产批号：0204242）。WWw.11665.cOm 1.2 细胞培养 mcf7细胞组织来源为人乳腺癌,上皮样贴壁生长，购于北京大学医学部分子生物中心。3天左右传代一次,0.25%胰蛋白酶消化,新鲜配制含 10%胎牛血清的prmi1640培养基在37℃、5% co2及饱和湿度环境下培养。 1.3 survivin sirna的制备 根据elbashir等[1]确定的sirna的特点，利用t7rna聚合酶体外转录合成sirna的方法[2]，筛选出了一条rna干扰survivin基因的靶序列。这条序列通过计算机经blast检索证明与survivin以外的人类基因无同源性。 survivin target mrna 5′ gtctggcgtaagatgatgg 3′ sirna 5′ gucuggcguaagaugaugguu3′sene strand 3′ uucagaccgcauucuacuacc5′antisense strand1.4 联合用药体外抗肿瘤活性测定 在96孔细胞培养板中，每孔加入含4×103个mcf7细胞的100μl培养液，置37℃、5％co2孵箱培养24h。在无血清无双抗状态下，用脂质体lipofectintm2000，按其说明书进行sirna的转染，sirna的最终浓度为5nm。 转染6h后，换含不同浓度5fu的培养液100μl。化疗药物5fu取其ic50上下的5个浓度（ic50为5fu对经脂质体处理后的mcf7细胞的半数致死剂量）（5fu：1.25、2.5、5、10、20μg/ml）分别与sirna相组合，每种浓度组合重复4孔，以单用sirna及单用5fu（预先经脂质体处理）作为单药对照组，以经脂质体处理后不加药组作为空白对照。继续培养48h后，每孔加20μl mts，置于37℃、5％co2孵箱90min后，用多功能酶标仪测定吸光度a490nm，并计算细胞增殖抑制率i。 i%=（a对照-a测定）/（a对照-a空白）×100% 1．5 统计学方法 采用sas统计软件进行析因分析。 1．6 协同作用分析方法 评价联合用药对肿瘤细胞的抑制是否有协同作用，参照文献[3，4]以金正均q值法判断：q=ea+b/(ea+eb-ea×eb)，其中ea+b为合并用药的抑制率，ea和eb分别为a药和b药单独用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母是“期望合并效应”，q是两者之比。q＜0.85为拮抗，0.85≤q＜1.15为相加，q≥1.15为协同。 2 结果 2．1 联合用药对mcf7细胞增殖的抑制 图1表明，单用5fu，ic50为4.42μg/ml；加入5nmol/l sirna后，ic50降为1.18μg/ml。上述结果说明在化疗药物中加入survivin sirna后，药物对mcf7的抑制效果均有明显增加，并且可以看出随着化疗药物浓度的增加，抑制率增高的趋势均逐渐变缓。 2.2 对化疗药物5fu与sirna联用进行析因设计的方差分析 采用sas统计软件对以上数据进行分析，sirna+5fu的f值为26.74，p值均 0.01。 2.3 survivin sirna与化疗药物5fu之间的交互作用分析 采用药理学上较为经典的方法即金正均q值法[3,4]分析两药之间的交互作用。由表1中q值可以看出，在5fu为低浓度时，与sirna联合用药均可得到较好的协同作用（q≥1.15），升高5fu浓度后，协同作用下降，直至转为相加作用，但没有出现拮抗作用。表1 sirna与5fu联合用药对mcf7细胞抑制率的协同性观察 3 讨论 乳腺癌的发生发展是一个多步骤、多因素的复杂过程。在此过程中，凋亡抑制基因survivin通过抑制凋亡蛋白酶，干扰细胞周期，使已转化的细胞进行异常有丝分裂，导致乳腺上皮细胞的永生化或癌变。研究表明乳腺癌组织中survivin的表达率可达72.3%[5] 。而rna干扰（rnai）是通过人为引入与内源靶基因具有相同序列的双链rna，诱导内源靶基因的mrna降解，阻止基因表达，达到基因治疗的目的[6,7]。 3．1 survivin sirna与乳腺癌细胞mcf7对5fu的敏感性 5fu是影响核酸生物合成的药物，是抗代谢药物之一。这类药物模拟正常代谢物质，如叶酸、嘌呤碱、嘧啶碱等的化学结构，在细胞周期s期与有关代谢物质发生特异性的拮抗作用，从而干扰核酸，尤其是dna的生物合成，阻止瘤细胞的分裂繁殖5fu对多种肿瘤有效，特别是对消化道癌症和乳腺癌疗效较好。 我们在实验中用survivn sirna转染人乳腺癌细胞，以ic50(50％ inhibitionconcentration)来表示乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。ic50越小，表示肿瘤细胞对化疗药物的敏感性越大；反之则表示敏感性越小。结果，sirna转染细胞的ic50明显降低，对5fu的敏感性增加。用sas统计软件分析联合用药后药物对mcf7细胞增殖的抑制作用，表明5fu与survivin sirna之间的交互作用对结果起到了极显著的影响（p 0.001）。其中，低剂量的5fu（ 5μg/ml）不同程度地与sirna有协同作用（q≥1.15）。随着化疗药物浓度的增加，协同作用降低，但在所取浓度范围内都没有出现拮抗作用。提示化疗药物与survivin sirna联合用药, 可作用于细胞周期的不同环节, 降低细胞凋亡的阈值( threshold)，抑制肿瘤细胞增殖,促使肿瘤细胞凋亡增加,确实可以提高药物敏感性，降低化疗药物的剂量。 3．2 survivin sirna与常规化疗药耐药性和毒性 研究发现胰腺癌细胞经x线照射后，survivin mrna表达逐步升高，x线治疗后，survivin高表达的肿瘤细胞克隆形成率明显高于survivin弱表达的肿瘤细胞，可见，恶性细胞通过表达高水平survivin，可在化学治疗或放射治疗等细胞毒性状况下生存，从而获得化学抵抗[8]。在对食管癌化学治疗敏感性的研究中，对治疗部分反应的病人survivin mrna水平明显低于对治疗无效和进展期病人[9]。ikeguchi 等 [10]用顺铂治疗后，胃癌细胞survivin mrna和蛋白表达水平升高，治疗后48h，mrna 水平比未治疗细胞升高2 ～6倍，治疗后24h蛋白水平比未治疗升高3～6.5倍，提示survivin可能介导了细胞对顺铂治疗的抵抗。上述研究都提示了survivin在恶性细胞对放、化疗抵抗中起重要作用。这可能由于survivin既调节凋亡，又控制有丝分裂，维持肿瘤细胞生存。在细胞分裂中，survivin控制微管稳定性，装配正常的有丝分裂纺锤体，其过表达有助于细胞逃逸化学治疗和放射治疗诱导的g2/m期凋亡检查点，促进肿瘤细胞对放、化疗的抵抗作用，而sirna转染能封闭survivin的表达，在一定程度上使细胞耐药逆转。 可见，survivin sirna与小剂量化疗药物5fu联用既可以提高疗效，还可以降低抗癌药物使用剂量，这将有助于克服单用化疗药所引起的毒副作用大的缺点，并有助于解决单用sirna治疗难以完全抑制肿瘤的生长且成本较高等问题。另外， survivin蛋白表达所引起的乳腺癌细胞凋亡机制的缺陷,在一定程度上参与了乳腺癌细胞对化疗药物耐药性的产生。对于癌症晚期及不适于手术治疗的癌症病人，sirna和化疗药物联用有其独特的优势和光明的前景，值得在相互作用的分子机制方面进行深入研究。 【参考文献】 [1]elbashir sm, harborth j , lendeckel w, et al . duplex of 21 23 nucleotide rnas mediate rna interferen in cultured mammalian cells[j].nature,2001,411(6836)：494498. [2] 张淑群,杜清友,杨英,等. polymerase synthesis and potential interference of a small interfering rna targeting hpim2[j].world journal of gastroenternology,2004,10(18):26572660. [3] 戴体俊.合并用药的定量分析[j].中国药理学通报，1980，14(5)：479480. [4] 金正均.合并用药中的相加[j].中国药理学报，1980，1(1)：7076. [5] 张淑群,强水云,杨文彬,等.survivin蛋白在乳腺癌发生、发展不同阶段的表达及意义[j].癌症,2004,23(6):697700. [6] sohail m,doran g,riedemann j, et al. a simple and cost effective method for producing small interfering rnas with high efficacy[j].nucleic acids res, 2003, 31 (7)：e3842. [7] wilda m,fuchs u,wossmann w,et al. killing of leukemic cells with a bcr/abl fusion gene by rna interference (rnai)[j].oncogene,2002,21(37):57165724. [8] asanuma k, moriai r, yajima t,et al. survivin as a radioresistance factor in pancreatic cancer [j]. jpn j cancer res,2000,91(11):12041209. [9] kato j, kuwabara y,mitani m,et al. expression of survivin in esophageal cancer:correlation with the prognosis and response to chemotherapy[j].int j cancer,2001,95(2):9295.