内容
【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌（nsclc）上皮间质转化(emt)与表皮生长因子受体(egfr)突变和临床病理特征之间的关系。方法 采用免疫组化法检测nsclc患者癌组织中e钙黏素和波蛋白的表达情况。采用卡方检验和logistic回归分析，探讨临床病理特征和egfr基因型nsclc中emt的影响。结果 62例nsclc标本中，上皮表型35.48%（22/62）。egfr突变nsclc中，上皮表型显著高于野生型(77.78% vs 18.18%；p 0.0001)；女性显著高于男性(54.55% vs 25%；p=0.02)；腺癌高于其他病理类型(39.47% vs 29.17%；p=0.4087)；不吸烟者稍高于吸烟者(42.42% vs 27.59%；p=0.2231)；年龄 60岁和年龄≥60岁组差异无统计学意义(43.33% vs 28.12%；p=0.211)，早期肺癌与晚期肺癌组差异无统计学意义(38.24% vs 32.12%；p=0.6178)。结论 egfr突变型、女性、非吸烟者、腺癌倾向于上皮表型，与egfr酪氨酸激酶抑制剂疗效分布人群的临床特征相一致。 【关键词】 上皮 间质转化 肺癌 表皮生长因子受 酪氨酸激酶抑制剂 肺癌是世界上恶性肿瘤死亡的首要原因。尽管临床医师不断提高了诊治水平，肺癌对现有的手术及化放疗的反应仍难尽人意。分子靶向治疗由于其选择性高、毒性低而倍受青睐。wWw.11665.com针对肿瘤分子靶向治疗中存在的如何选择合适的患者人群及如何预测疗效等问题也成为日益关注的焦点。 上皮细胞间质转化(epithelialmesenchymal transition, emt)是上皮细胞在与周围间质的相互作用过程中逐渐获得了某些间质细胞特有性状的现象，以e钙黏素（ecadherin）、连环蛋白（catenin）等表征上皮型指标蛋白的丧失以及波蛋白（vimentin）和纤维粘连蛋白（fibronectin）等表征间质型指标蛋白的获得为主要特征，并且与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系[1]。最新研究显示，上皮型的肺癌对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, egfr) 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,tki)治疗较间质化改变的敏感，提示肺癌的emt状态有望成为靶向治疗疗效的预测因素应用于临床[2，3]。本研究将对非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, nsclc）的emt状态与egfr基因型以及患者临床病理特征间的关系进行探讨，为ecadherin、vimentin、fibronectin等emt标志物作为治疗预测因子最终应用于临床做前期研究。 1 资料与方法 1．1 临床资料 收集上海市肺科医院2003年9月～2004年6月行手术切除并经病理证实的nsclc标本62例。其中男40例、女22例。中位年龄62岁（39～83岁）；病理类型：腺癌38例、鳞癌24例、鳞腺混合癌2例；按1997年uicc修订的肺癌tnm病理分期标准：i期29例、ii期5例、iii期25例和iv期3例。各例术前均未接受化疗和放疗。 1．2 nsclc的egfr突变分析 采用上海华舜生物有限公司小量组织细胞基因组dna快速抽提纯化试剂盒抽提冰冻组织的基因组dna。按照paez等[4]报道的方法，采用巢式pcr技术对egfr基因的18、19、21外显子进行扩增。扩增片段包含外显子及其相连的内含子部分。pcr条件：变性95℃ 15min；95℃ 20s、60℃ 30s和72℃ 1min 循环35次；延伸72℃10min。pcr产物送交上海基康生物技术有限公司进行测序鉴定egfr基因18、19和21外显子突变区域。 1．3 免疫组织化学检测 采用免疫组织化学方法（sp法)检测nsclc组织中ecadherin和vimentin的表达。ecadherin和vimentin抗体均为鼠抗人单克隆抗体，购自上海长岛公司，工作液浓度为1∶100。石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复等处理后加入一抗4℃过夜。二抗37℃ 30min；dab显色；苏木素复染；盐酸酒精分化；脱水、透明；中性树脂封固。用已知阳性切片做阳性对照，pbs代替一抗做阴性对照。 结果判定：胞膜和（或）胞浆着棕黄色染色颗粒提示阳性显色结果。随机观察10个高倍视野，根据切片中癌细胞阳性数的有、无及阳性细胞的百分率将表达结果分为：阴性（-）为无棕黄色染色或染色阳性细胞数 10%；弱阳性（+）为阳性细胞数10%～24%；中等阳性（++）为阳性细胞数25%～49%；强阳性（+++）为阳性细胞数≥50%。 1．4 统计学方法 采用卡方检验分析emt现象和年龄、性别、肿瘤分期、组织类型、吸烟情况以及egfr基因型等因素的关系；logistic回归分析进一步检验各因素与emt状态的关系；计算kappa值对ecadherin染色和 vimentin染色表征emt状态一致性进行检验。所有统计学分析均采用sas9.0进行，p 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2．1 nsclc的egfr突变分析 62例肺癌标本中，18例患者存在egfr基因的突变，突变率为29.03%（18/62）。其中12例为缺失突变，6例点突变，egfr基因点突变或缺失突变均为杂合型。所有缺失突变都发生在19外显子的密码子的egfr tk区域。所有点突变都发生在21外显子的密码子858，造成tg转换。但未检测到18外显子的基因突变，见图1。 2.2 ecadherin和 vimentin在nsclc的表达及与egfr基因型的关系 ecadherin主要定位于肿瘤细胞膜，少量细胞浆染色，在nsclc组织中阳性表达率为35.48%（22/62），见图2。egfr基因突变的肿瘤ecadherin的表达水平显著高于egfr野生型（77.78% vs 18.18%，p 0.0001）。 vimentin主要表达于胞膜和胞浆，阳性表达率为67.74%（42/62），见图3。egfr野生型vimentin表达水平较突变型显著增高(84.09% vs 27.78%)。两例标本ecadherin和vimentin同时表达为阳性。 2．3 肺癌emt状态与egfr基因型、临床病理特征的关系 按照yauch等[3]的报道，胞膜染色/胞浆染色与western blot结果有很好的一致性，采用免疫组化结果表征emt状态具有较高的可靠性。以ecadherin阳性、vimentin阴性表征上皮型，反之表征间质型。kappa 值分析提示以ecadherin和vimentin染色来确定emt状态的结果有较高一致性(kappa=0.9281；95%可信区间，0.8303～1.0259；p 0.0001)，因此选择ecadherin染色表征肺癌的emt状态。 统计结果显示：nsclc上皮表型占35.48%（22/62）。上皮表型在egfr突变型显著高于野生型(77.78% vs 18.18%；p 0.0001)；女性显著高于男性(54.55% vs 25%；p=0.02)；腺癌高于其他病病理类型但差异无统计学意义(39.47% vs 29.17%；p=0.4087) ；不吸烟者稍高于吸烟者，差异无统计学意义(42.42% vs 27.59%；p=0.2231)；年龄 60岁和年龄≥60岁组差异无统计学意义(43.33% vs 28.12%；p=0.211)，早期肺癌与晚期肺癌组差异无统计学意义(38.24% vs 32.12%；p=0.6178，见表1。表1 62例肺癌患者的肿瘤emt标志物与egfr基因*：包括鳞癌、鳞腺混合癌和腺癌；**：kappa一致性分析提示ecadherin和vimentin染色有很高的一致性，我们最终选择ecadherin染色表征肺癌的emt状态。p（卡方检验）按照ecadherin 染色结果计算 logistic回归分析显示上皮表型与egfr突变密切相关(比值比，0.094；95%可信区间，0.026～0.349；p=0.0004)。由于上皮型和间质型在年龄、临床分期和吸烟情况分层差异无统计学意义，未对这些因素与上皮型关系行logistic回归分析。 3 讨论 针对egfr的靶向药物已显示出良好的临床疗效，但并非所有患者都能从小分子egfr tki（gefitinib和erlontinib）治疗中获益。gefitinib和erlontinib用于二线或三线治疗nsclc，客观缓解率在9%～19%之间，另外约50%的病例出现病情进展。诸多研究已发现在亚裔、女性、不吸烟、腺癌等患者中疗效好。然而，试图以分子预测指标来区分适合egfr tki治疗的患者人群的研究结果还不能令人满意。最初关于egfr靶向治疗有效的合理推测是egfr在肺癌组织较癌旁组织过表达，但是对动物模型及临床患者标本的分析结果都表明肿瘤组织egfr高表达并非egfr tki治疗敏感的预测指标；同样，egfr的酪氨酸激酶（tyrosine kinase，tk)功能域发生突变与治疗敏感性密切相关的结论虽然广为认可，但是研究表明大约10%egfr野生型的患者也能从egfr tki治疗中获得较好的疗效[48]。因此有必要寻找新的能更有效预测egfr tki敏感性的指标。 emt是生物胚胎形成和发育常见的生理过程，同时emt还存在于多种病理过程。最新研究显示：表达ecadherin的nsclc对egfr tki治疗敏感，而表达vimentin/fibronectin的nsclc，则对egfr tki不敏感[2，3]。当发生emt的肺癌重新表达ecadherin后，肿瘤细胞则恢复对egfr tki治疗的敏感性。yauch等报道对erlotinib不敏感的肺癌组织往往合并vimentin和(或)fibronectin等标记物的表达[2，3]，进而推测ecadherin表达水平可作为预测nsclc患者对erlotinib临床效果的一个新的生物学标记。对于肿瘤发生emt后egfr tki治疗敏感性下降，可以理解为emt可能降低了肿瘤细胞生长或增殖对egfr信号通路的需求。例如，当间质表型细胞出现持续的akt激活，引发了非egfr依赖性的pi3k/akt信号通路激活，从而导致了肿瘤细胞对erlotinib等治疗的不敏感[9]。所以，肿瘤的emt状态与egfr tki的治疗反应性密切相关。在本研究中，我们检测了62例肺癌标本的emt状态，进而探讨了肿瘤emt状态与egfr基因型、以及该患者临床病理特征的关系。 组织染色结果显示77.78%的egfr基因突变的患者ecadherin表达阳性提示为上皮型，与egfr基因突变的患者egfr tki临床有效率相近，提示ecadherin表达水平可能是预测nsclc患者对egfr tki临床疗效的可靠指标。在egfr野生型患者中ecadherin的表达率仅为18.18%，而vimentin表达率为84.09%，以间质型为主。目前对egfr基因野生型患者缺乏有效的治疗敏感的生物学标记，与耐受egfr tki治疗有关的指标无论是20外显子的突变还是kras突变，在中国人群中发生率很低，而本研究观察到ecadherin的表达率与文献报道的egfr野生型患者egfr tki临床有效率相近，因此，以上皮或间质型来区分那些最可能受益于靶向egfr治疗的患者人群具有重要的临床意义。我们的研究结果似乎与以往egfr突变型的结构性活化会导致间质转化、肿瘤细胞迁移、侵袭和远处转移等结果不一致[10]。其中的机制值得进一步研究，因为emt的发生需要src、mapk及 pi3k等众多信号通路的参与，而这些信号通路又同时参与了egfr的胞内信号转导并且与egfr tki的耐药密切相关，至于egfr信号转导通路是如何与emt发生关系目前尚未清楚。推测上皮型或间质型受egfr基因突变的影响，突变型患者肿瘤多呈上皮型，而野生型肿瘤出现间质型转化。在这62例nsclc患者中，女性患者的上皮表型显著高于男性，差异具有统计学意义；腺癌类型以及非吸烟者也倾向于呈现上皮表型，与临床上gefitinib有效人群的特征一致。值得注意的是，在较早期的肺癌和较晚期的肺癌间却没有发现上皮表型的差异。因为既然emt与肿瘤的侵袭和转移有关，那么在晚期肺癌中应该更多的呈现间质型改变。还有一种可能可以解释早期肺癌和晚期肺癌间无上皮表型差异的结果，即远处转移的肿瘤较多的表现为间质化，而原发肿瘤仍较多的呈现上皮型，而我们获取的均为原发肿瘤组织。 总之，本研究发现egfr突变型、女性、非吸烟者、腺癌倾向于上皮表型，与egfr tki疗效分布人群的临床特征相一致；进一步分析显示，egfr突变型和野生型的ecadherin表达率均与文献报道的该组患者的egfr tki临床有效率相近。因此推测上皮型或间质型很可能作为一种egfr tki临床治疗疗效的预测因子。 【参考文献】 ［1］ thiery jp. epithelialmesenchymal transitions in development and pathologies[j]. curr opin cell biol, 2003, 15(6):740746. ［2］ thomson s, buck e, petti f, et al. epithelial to mesenchymal transition is a determinant of sensitivity of nonsmallcell lung carcinoma cell lines and xenografts to epidermal growth factor receptor inhibition[j]. cancer res, 2005, 65(20):94559462. ［3］ yauch rl, januario t, eberhard da, et al. epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients[j]. clin cancer res, 2005, 11(24):86868698. ［4］ paez jg, janne pa, lee jc, et al. egfr mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy[j]. science, 2004, 304(5676):14971500. ［5］ lynch tj, bell dw, sordella r, et al. activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of nonsmallcell lung cancer to gefitinib[j]. n engl j med, 2004, 350(21):21292139. ［6］ mitsudomi t, kosaka t, endoh h, et al. mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with nonsmallcell lung cancer with postoperative recurrence[j]. j clin oncol, 2005, 23(11):25132520. ［7］ pao w, miller v, zakowski m, et al. egf receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib[j]. proc natl acad sci usa, 2004, 101(36):1330613311. ［8］ tokumo m, toyooka s, kiura k, et al. the relationship between epidermal growth factor receptor mutations and clinicopathologic features in nonsmall cell lung cancers[j]. clin cancer res, 2005, 11(3):11671173. ［9］ bremnes rm, veve r, gabrielson e, et al. highthroughput tissue microarray analysis used to evaluate biology and prognostic significance of the ecadherin pathway in nonsmallcell lung cancer[j]. j clin oncol, 2002, 20(10):24172428.