内容
作者：黄琼林, 杨锦芬，段中岗，何瑞，詹若挺，徐鸿华，徐晖，陈蔚文
【摘要】 【目的】 建立阳春砂不同栽培品种的dna分子鉴别方法，为阳春砂的优良品种选育提供依据。【方法】以阳春砂栽培种长果、圆果、“春选”及海南砂为材料，用相应引物对26s rdna d1d3区和matk基因进行聚合酶链反应（pcr）扩增和测序，对测序结果进行分析，寻找差异位点，并根据序列构建系统发生树。【结果】测序得到的26s rdna d1d3序列为739 bp，阳春砂与海南砂在该区域存在4个碱基位点的差异。长果阳春砂与圆果阳春砂序列相同，但它们与“春选”阳春砂存在1个碱基位点的差异，根据26s rdna d1d3序列建立的系统发生树揭示了“春选”阳春砂与另外2个栽培品种间的区别。测序得到的matk序列为824 bp，阳春砂3个栽培品种的matk序列相同，与海南砂存在1个碱基位点差异。【结论】从分子水平上可鉴别阳春砂的3个栽培品种，“春选”品种比长果（或圆果）品种与海南砂有着更近的亲缘关系。
【关键词】 阳春砂 基因序列分析 分子鉴定
abstract∶objectiveto establish a molecular identification method for three cultivars of amomum villosum lour. (avl), thus to provide scientific evidence for the identification, selection and breeding of avl. methodsthe fragments of 26s rdna d1d3 region and matk gene of three cultivars of avl and amomum longiligulare tlwu were amplified by polymerase chain reaction (pcr) and with corresponding primers, and then their sequences were analyzed, and phylogenetic tree was constructed based on the sequences. resultswe obtained 739 bp in 26s rdna d1d3 sequence. differences in 4 basic sites of 739 bp were shown between avl and amomum longiligulare tlwu. the two cultivars of avl, changguo and yuanguo, had the same sequence, but there was a difference in one basic site of changguo and yuanguo from chunxuan. the phylogenetic tree based on 26s rdna d1d3 sequence revealed the difference between chunxuan and the other two cultivars of avl. we also obtained 824 bp in matk gene sequence. the three cultivars of avl showed the consistent sequence, but there was a difference in one basic site of three cultivars of avl from amomum longiligulare tlwu. conclusionwe can identify the three cultivars of avl through the sequence differences at the molecular level, and chunxuan has a closer genetic relationship with amomum longiligulare tlwu．
key words: amomum villosum lour.;sequence analysis;molecular identification;
砂仁为我国“四大南药”之一，来源于姜科植物阳春砂amomum villosum lour.、绿壳砂amomum villosum lourvarxanthioides tlwu et senjen或海南砂amomum longiligulare tlwu的干燥成果果实［1］。wWW.11665.cOm中国药典收载的入药砂仁的3种药材中以阳春砂的品质最好，为市场的主流产品［2］。本课题组在阳春砂道地产区广东阳春市进行了阳春砂的种质资源调查，发现当地药农在长期的生产实践中将阳春砂栽培品种主要归纳为长果型和圆果型，除此之外，还有在阳春市砂仁试验示范场种植的选育品种“春选”阳春砂。初步研究显示“春选”和长果、圆果阳春砂在生物学性状上有显著差异［3］。为了筛选优质性状，选育优良品种，从根本上提高阳春砂的产量和质量，需要对阳春砂不同栽培品种进行分子水平上的鉴别。
随着分子生物学技术的发展，植物dna序列由于进化速率上的差异而被广泛应用于不同物种种间及种内的鉴别。植物26s rdna上主要包含d1至d12共12个高变异的扩展区（expansion segment,es），这些扩展区的进化速率是保守区域的64至102倍，在系统发生的研究中有较大应用潜力［4］。目前，26s rdna序列已被用于植物系统发生分析［5-6］、dna条形码［7］等研究。matk基因是叶绿体基因组中进化速率较快的基因之一，可用于科内、属内、甚至种间的植物鉴别［8］。
本研究对道地产区3个阳春砂栽培品种和同为豆蔻属amonum的对照品种海南砂的26s rdna d1d3区和matk基因序列进行分析，以期在分子生物学水平上为阳春砂的品种鉴定和良种选育提供依据。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料阳春砂栽培种长果和“春选”采自阳春市砂仁试验示范场，圆果采自阳春市春湾，上述品种分别于2007年11月和2008年3月引种栽培于广州中医药大学大学城校区药王山。海南砂采自广州中医药大学三元里校区药圃。经广州中医药大学中药学院徐鸿华教授鉴定分别为姜科植物阳春砂（amomum villosum lour.）和海南砂（amomum longiligulare tlwu）。采集上述不同砂仁品种的叶片，保存于-70 ℃超低温冰箱备用。
1.2 药品和试剂三羟甲基氨基甲烷（tris）购自salandchem international inc.，十六烷基三甲基溴化铵（ctab）和聚乙烯吡咯烷酮（pvp）购自上海伯奥生物技术公司，乙二胺四乙酸二钠（edta）购自天津福晨化学试剂厂，β巯基乙醇、goldview染料购自广州鼎国生物技术公司，聚合酶链反应（pcr）试剂、dna markers购自大连宝生物技术公司，硅胶膜型pcr产物纯化试剂盒购自北京赛百盛基因技术公司，引物由上海生工生物工程技术公司合成。
ctab提取液配制［9］：30 g/l ctab、100 mmol/l trishcl(ph 80)、20 mmol/l edta、14 mol/l nacl、10 g/l pvp、体积分数02%β巯基乙醇（使用前加入）。
1.3 dna提取参照段中岗等［9］的ctab方法3。
1.4 琼脂糖凝胶电泳检测取5 μl dna溶液与10倍loading buffer约1 μl混匀后上样，电泳条件为1倍tae电泳缓冲液，100 g/l琼脂糖凝胶，100 v恒压电泳20 min，goldview染色。凝胶成像系统拍照记录。
1.5 pcr扩增用于扩增26s rdna d1d3区的上游引物为duan 5（5tagtaacggcgagcgaac3),下游引物为duan 6(5ggcatagttcaccat ctttc3)［7］。根据genbank中已公布的阳春砂matk全长序列（登记号：af478824）设计用于matk扩增的引物，上游引物为kf（5ctcacaatttacaatctagtcattc3）。下游引物为kr（5gaggatccactatgatagtgagaa3）。pcr反应体系总体积为20 μl，其中10倍ex taq buffer 2 μl、10 μmol/l三磷酸碱基脱氧核苷酸（dntp）15 μl，用灭菌蒸馏水补足体积。扩增程序为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 60 s(26s rdna d1d3)或 90 s(matk)，30个循环（26s rdna d1d3)或32个循环（matk）后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。pcr扩增产物用pcr产物纯化试剂盒回收后，送广州英骏生物技术公司采用上下游引物进行双向测序。
1.6 序列分析采用dnaman软件分别对长果、“春选”和圆果阳春砂及海南砂的上下游引物测序结果进行比对和拼接，分别获得上述品种的26s rdna d1d3区和matk基因序列。进行blastn（nucleotide blast）比对，确定所获序列。将不同品种的26s rdna d1d3区、matk基因序列进行多重序列比对，寻找碱基差异位点。用dnaman软件构建基于26s rdna d1d3区的不同品种系统发生树。 1.7 序列提交采用sequin软件向genbank提交26s rdna d1d3区和matk序列，获得相应的序列登记号。
2 结果与分析 2.1 dna提取结果见图1，dna样品在凝胶电泳上都得到了清晰、迁移率低的条带，没有太大程度的降解，浓度约为120~180 ng/μl。 26s rdna d1d3区prc扩增与序列分析对26s rdna d1d3区的pcr扩增获得约750 bp的片段（图2）。对各样品的pcr产物测序结果进行处理，通过dnaman软件进行序列拼接，分别获得了阳春砂3个栽培品种与海南砂的以“gaaccggg”为始端和以“gaaagatg”为末端的739 bp的26s rdna d1d3区序列。blastn同源性搜索结果显示，阳春砂3个栽培品种和海南砂的739 bp 26s rdna d1d3序列与同科的生姜的序列（af205522）最高相似性为94%。采用sequin软件向genbank提交了阳春砂3个栽培品种和海南砂的26s rdna d1d3序列，获得了相应的序列登记号：gq331042（长果阳春砂）、gq331044（“春选”阳春砂）、gq331043（圆果阳春砂）以及gq331045（海南砂）。
不同品种的26s rdna d1d3序列多重比对结果见图3。阳春砂和海南砂的26s rdna d1d3序列出现多处碱基差异，阳春砂3个栽培品种与海南砂在第377位、第420位和第448位处均显示为碱基t与碱基c的差异，在第387位处，长果、圆果阳春砂显示为碱基a，而“春选”阳春砂则与海南砂一致，显示为碱基c。 根据阳春砂3个栽培品种与海南砂的26s rdna d1d3序列，采用dnaman软件构建系统发生树（图4），结果显示，长果阳春砂和圆果阳春砂聚在一起，再与“春选”聚为一支，揭示了“春选”与另外2个阳春砂栽培品种在遗传上的明显区别。
2.3 matk基因的pcr扩增与序列分析对matk基因的pcr扩增得到约880 bp的片段（图5）。pcr产物测序得到以“ctacatat”为始端和以“tctaaaaa”为末端的824 bp的matk基因序列。经ncbi的blastn同源性搜索，阳春砂和海南砂的824 bp matk序列分别与genbank上公布的阳春砂和海南砂matk序列（分别为fj972786和fj972784）达到100%的相似性。向genbank提交序列，获得登记号gq404377（阳春砂）和gq404378（海南砂）。阳春砂3个栽培品种的matk序列完全一致，与海南砂存在一个碱基差异（图6）。
3 讨论
近年来dna序列分析应用于物种的鉴定和分子育种等方面日趋广泛，尤其是2002年dna条形码技术提出以来，不少学者与研究人员都致力于寻找一段标准dna序列作为标记来实现快速、准确和自动化的物种鉴定［7，10］。庞启华等［11］利用部分matk基因序列中的18个核苷酸替换位点对高良姜及其混淆品进行鉴定。selvaraj等［12］通过研究认为matk基因是鉴别姜科植物的较好的候选dna条形码。段中岗等［7］也提出以26s d1d3区与matk基因作为被子植物类中药材的标准dna条形码。
本研究结果显示阳春砂3个栽培品种的26s rdna d1d3序列均在469 bp处出现杂合碱基，为了消除实验中的个体差异，保证序列差异的可靠性，我们以阳春砂各栽培品种的3个样品和海南砂的2个样品进行多次正反向测序和序列比对，最终每个品种确定为长739 bp的唯一序列。本研究利用26s rdna d1d3序列对阳春砂和海南砂的有效鉴别检验了该方法的可靠性。通过第387位处的碱基位点差异，使阳春砂的“春选”品种和长果、圆果品种得以区分，这与本课题组已发现的“春选”与长果、圆果品种存在生物学性状差异［3］的事实一致。据本课题组对阳春市砂仁栽培品种的实地调查，“春选”可能是砂仁试验示范场对阳春砂与海南砂人工杂交所获得的后代，但没有相关的实验记录证明。本研究的结果表明，在26s rdna d1d3区序列第387位的差异位点处，“春选”与海南砂的碱基相同，而与长果、圆果不同，这一结果说明“春选”比长果（或圆果）阳春砂与海南砂具有更近的亲缘关系。阳春砂栽培种长果与圆果在果型等性状特征上具有较明显的差别［3］，但在26s rdna d1d3区的dna序列上未找到碱基差异，表明这2个农家品种的分化时间并不长久。本课题组也曾参考文献［13］的方法，对its158sits2序列进行分析，未找到能区别阳春砂3个栽培品种的碱基位点。
在本实验获得的824 bp的matk基因部分序列中，存在海南砂与阳春砂的差异位点，但阳春砂各个栽培品种间则不存在序列差异，表明matk基因在阳春砂的3个栽培品种间具有高度的保守性，不适用于阳春砂栽培品种间的鉴别。26s rdna d1d3区序列比matk基因序列提供了更多的碱基差异信息，并且差异位点相对集中，因此对阳春砂的分子鉴定更具有意义。
【参考文献】 ［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［m］.北京：化学工业出版社，2005：177. ［2］张丹雁，刘军民，徐鸿华.阳春砂不同栽培品种的比较鉴别［j］.广州中医药大学学报，2005，22（1）：1. ［3］杨锦芬，何瑞，詹若挺，等.道地产区阳春砂不同栽培品种果实、花形态特征的调查与分析研究［c］.全国第八届天然药物资源学术研究会论文集，2008：428. ［4］kuzoff p k，sweere j a,soltis d e,et al.the phylogenetic potential of entire 26s rdna sequences in plants［j］.mol biol evol,1996,15(3):251. ［5］douglas e s,anne e s,michael j z,et al.gunnerales are sister to other core eudicots:implications for the evolution of pentamery［j］.american journal of botany,2003,90:461. ［6］fan c,xiang q.phylogenetic relationships within cornus(cornaceae)based on 26s rdna sequences［j］.am j bot,2001,88(6):1131. ［7］段中岗，陈蔚文.中药材dna条形码研究［r］.广州中医药大学博士后出站研究工作报告，2008：46，65. ［8］徐凤霞.木兰族和含笑族和系统学关系——基于叶绿体matk基因序列分析［j］.西北植物学报，2003，23（7）：1169. ［9］段中岗，黄琼林，杨锦芬，等.适合中药材dna条形码分析的dna提取方法的研究［j］.中药新药与临床药理，2009，20（5）：480. ［10］肖金花，肖晖，黄戴维.生物分类学的新动向——dna条形编码［j］.动物学报，2004，50（5）：852. ［11］ping qihua,yan ping,zhao xuan,et al.identification of alpinia officinarum hance and its adulterant base on matk gene sequence［j］.journal of shanxi university of science and technology,2008,26(4):11. ［12］selvaraj d,sarma r k,sathishkumar r.phylogenetic analysis of chloroplast matk gene from zingiberaceae for plant dna barcoding［j］.bioinformation,2008,3(1):24. ［13］周联，王培训，黄丰，等.阳春砂的its序列分析［j］.中草药，2002，33（1）：72.