内容
【摘要】 目的 构建htert启动子调控的融合自杀基因cd:uprt表达载体，研究其对人胃癌细胞sgc7901的体外靶向性杀伤作用。方法 pcr扩增htert核心启动子片段，克隆入荧光素酶报告基因质粒pgl3basic，检测htert启动子在人胃癌细胞sgc7901和人成纤维细胞hlf中的转录活性。构建htert启动子调控的cd:uprt基因表达载体htertcd:uprt，将其和cmv启动子调控的cd:uprt基因表达载体pcdna3.1cd:uprt用脂质体转染法分别转染入sgc7901和hlf细胞，筛选稳定表达细胞系，用rtpcr和western blot方法检测cd基因的表达，用mtt法检测5fc对转染细胞的杀伤作用。结果 成功克隆htert核心启动子；荧光素酶活性检测显示，htert启动子在sgc7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%，而在hlf细胞中仅有背景活性。成功构建htert启动子调控的cd:uprt基因表达载体，转染pcdna3.1cd:uprt的sgc7901和hlf细胞以及转染htertcd:uprt的sgc7901细胞在mrna和蛋白质水平均可检测到cd基因的表达，且对5fc敏感；而转染htertcd:uprt的hlf细胞未检测到cd基因的表达，对5fc不敏感。结论 构建的htert启动子调控的融合自杀基因系统cd:uprt/5fc能在体外靶向性杀伤sgc7901细胞。 【关键词】 人端粒酶逆转录酶启动子 胞嘧啶脱氨酶 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 胃癌 靶向基因治疗 自杀基因疗法日益受到人们的关注[1]。wWW.11665.CoMcd:uprt/5fc(胞嘧啶脱氨酶:尿嘧啶磷酸核糖转移酶/5氟胞嘧啶，cytosine deaminsae: uracil phosphoribosyltransferase/5flurocytosine)是一种高效的自杀基因系统，它将传统的自杀基因cd与uprt基因联合，构成融合自杀基因，显著提高了抑瘤效果。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，htert）是细胞端粒酶活性主要决定因素，在绝大部分肿瘤细胞中重新激活，而在大部分正常体细胞中表达阴性[2]，故htert启动子可为基因治疗提供靶向性。本研究构建了htert启动子调控的cd:uprt/5fc自杀基因表达载体，研究其对人胃癌细胞sgc7901的靶向杀伤作用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞和质粒 人胃癌细胞sgc7901和人宫颈癌细胞hela为中南大学湘雅医学院肿瘤研究所保存；正常人成纤维细胞hlf购自中南大学湘雅医学院中心实验室。荧光素酶报告基因质粒pgl3basic、pgl3control为美国promega公司产品；质粒pcdna3.1cd:uprt由本室构建。 1.1.2 主要试剂 la taq酶试剂盒、amv逆转录试剂盒、限制性内切酶均为大连宝生物公司产品，pgemt easy载体、萤光素酶检测试剂盒、βgal检测试剂盒均为美国promega公司产品，lipofectamine2000脂质体为美国invitrogen公司产品，引物为上海英骏生物技术有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 htert启动子的pcr扩增及鉴定 以p1: 5′gcgacgcgtgattcgcgggcacagacg3′，p2: 5′aaactcgagccacgtgcgcagcaggac3′为上下游引物（分别引入mlu ⅰ、xho ⅰ酶切位点），以hela细胞的基因组dna为模板，用takara la taq酶扩增htert启动子，克隆入pgemt easy载体，构建成pgemhtert质粒，大连宝生物公司测序鉴定。 1.2.2 htertpgl3basic重组质粒的构建及鉴定 将构建的pgemhtert用mluⅰ和xhoⅰ作双酶切，回收约255bp的htert启动子片段，克隆入pgl3basic，构建成htertpgl3basic质粒，用pcr和双酶切法鉴定。 1.2.3 htert启动子转录活性的检测 将sgc7901、hlf细胞按每孔1×105个细胞接种至24孔板，当细胞达到85%融合度时进行转染。每种细胞分别转染3种质粒，即htertpgl3basic、pgl3basic、pgl3control，并加βgal作为内对照，48h后检测荧光素酶活性与βgal活性，以两者之比作为荧光素酶相对活性。 1.2.4 htertcd:uprt表达载体的构建及鉴定 pgemhtert用mlu ⅰ和xho ⅰ作双酶切，回收约255bp的htert启动子片段，将其克隆入同样用mlu ⅰ和xho ⅰ作双酶切的pcdna3.1cd:uprt（切除cmv启动子），得到质粒htertcd:uprt，用pcr和双酶切两种方法鉴定。 1.2.5 质粒转染及阳性克隆的筛选 用lipofectamine2000脂质体将pcdna3.1cd:uprt和htertcd:uprt分别转染sgc7901、hlf细胞，g418筛选出稳定转染的细胞系，分别命名为sgc7901/pcdna3.1cd:uprt、sgc7901/htertcd:uprt、hlf/pcdna3.1cd:uprt、hlf/htertcd:uprt。 1.2.6 rtpcr检测cd基因的表达 提取细胞总rna，按amv逆转录试剂操作步骤进行逆转录，pcr扩增cd基因，所用上下游引物分别为p1: 5′atggtgacagggggaatg3′，p2: 5′ttgtgaccacgaccgaga3′。 1.2.7 western blot检测cd基因的表达 提取细胞总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭2h，1∶500稀释的鼠抗cd多克隆抗体(qed公司)4℃孵育过夜，1∶1 000稀释的兔抗鼠二抗(sigma公司)室温孵育1h，显色、分析结果。 1.2.8 mtt法检测细胞存活率 将各组细胞以5×103个细胞/孔接种于96孔培养板中，孵育过夜，加入5fc，使其终浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml，混匀后孵育4d，以mtt法检测细胞存活率。 1.3 统计学方法 采用spss12.0统计软件进行t检验和方差分析。 2 结果 2.1 htert启动子的pcr扩增及鉴定 pcr扩增得到约267bp的dna片段，见图1，与预期结果一致；pgemhtert载体测序结果显示，克隆的htert序列与genbank (序列号：ab016767)中htert序列完全一致。 2.2 htertpgl3basic重组质粒的构建及鉴定 构建的htertpgl3basic用pcr法扩增htert，得到约267bp的片段，与预期结果一致；用mluⅰ和xhoⅰ双酶切鉴定，得到约255bp和4.8kb大小的dna片段，与预期结果一致，见图1。 2.3 htert启动子转录活性的检测 以pgl3control为阳性对照（100％），htert在各细胞中的相对转录活性见表1，htert启动子在hlf细胞中仅有背景转录活性，在sgc7901细胞中显示了较高的转录活性，为阳性对照的(21.50±2.15)％。表1 htert启动子转录活性 basicsgc7901100％(21.50±2.15)%(0.51±0.07)%hlf100％(0.40±0.07)%(0.34±0.04)% 2.4 htertcd:uprt表达载体的构建及鉴定 构建的htertcd:uprt用pcr法扩增htert，得到约267bp的片段，与预期结果一致；用mlu ⅰ和xho ⅰ作双酶切鉴定，得到约255bp和6.4 kb大小的片段，与预期结果一致，见图2。 2.5 rtpcr检测cd基因的表达 结果显示sgc7901/pcdna3.1cd:uprt、sgc7901/htertcd:uprt、hlf/pcdna3.1cd:uprt组扩增出约152bp的cd基因产物，hlf/htertcd:uprt和阴性对照组无cd基因的表达，见图3。 2.6 western blot检测cd基因的表达 结果显示sgc7901/pcdna3.1cd:uprt、sgc7901/htertcd:uprt、hlf/pcdna3.1cd:uprt组有相对分子量约为4.2kd的cd:uprt融合蛋白的表达，hlf/htertcd:uprt和阴性对照组无cd:uprt的表达,见图4。 1: sgc7901/pcdna3.1cd:uprt；2: sgc7901/htertcd:uprt；3: sgc7901；4: hlf/pcdna3.1cd:uprt；5: hlf/htertcd:uprt；6: hlf 图4 western blot检测cd:uprt的表达 2.7 mtt法检测细胞存活率 5fc对转染htertcd:uprt的sgc7901细胞显示明显的杀伤作用，5fc为400μg/ml时细胞存活率仅为10.21%，对转染htertcd:uprt的hlf细胞无明显杀伤作用；而5fc对转染pcdna3.1cd:uprt的sgc7901和hlf细胞均显示明显的杀伤作用，见图5。 图5 不同浓度的5fc对各组细胞的杀伤作用 3 讨论 自杀基因疗法之所以受到人们重视，原因之一是其强大的旁观者效应。旁观者效应使得转基因细胞被杀死的同时，周围大量未转基因的细胞亦被杀死[3,4]，这就解决了基因治疗的一个主要障碍即基因转移的效率问题。 cd:uprt/5fc自杀基因系统是通过cd酶（cytosine deaminsae，胞嘧啶脱氨酶）将无毒的5fc转化为有毒的5fu，5fu在体内经一系列酶促反应转变成5fump（5fluorouridine monophosphate），再进一步形成futp和fdump，进而干扰rna和dna的合成，发挥抗肿瘤作用。uprt是来源于细菌等微生物中的一种嘧啶补救酶，能直接催化5fu转化为5fump，减少多种竞争酶对5fu降解，而提高5fu的疗效[5,6]。chungfaye等[7]研究发现转染cd:uprt基因和转染cd基因的结肠癌细胞相比，前者对5fc的敏感性是后者的100倍，且显示出更强的旁观者效应。 靶向性是基因治疗关键问题之一。端粒酶在大部分正常体细胞中表达为阴性[8]，而在约85％的人类恶性肿瘤中端粒酶激活[9]。htert是端粒酶的催化亚单位，是端粒酶活性的主要决定因素。在端粒酶的激活过程中，htert在细胞中的表达是决定端粒酶活性的限速步骤[2]。htert的表达调控主要发生在转录水平，其转录起始位点上游近端约181bp为核心启动子区域，为htert转录激活所必需[10]。因此htert启动子可用于肿瘤的靶向基因治疗。 本研究中，我们扩增了htert基因atg上游120～ 369之间的249bp的启动子序列，包含了上述的核心启动子区域。通过荧光素酶报告基因系统进行启动子活性分析，结果显示在端粒酶阳性的sgc7901细胞中htert启动子活性显著增高，为阳性对照pgl3control的(21.50±2.15)%，而在端粒酶阴性的hlf细胞中仅有背景活性，证实htert启动子可以调控下游基因在端粒酶阳性的细胞中特异性表达。 进一步的研究显示，在转染cmv启动子调控的pcdna3.1cd:uprt后，sgc7901和hlf细胞中均有cd基因的表达，对5fc敏感，说明cmv启动子不具有肿瘤特异性；而在转染htertcd:uprt后，仅sgc7901细胞中检测出cd基因的表达，且对5fc敏感，在hlf细胞中则无cd基因的表达，对5fc亦不敏感，这说明htert启动子具有肿瘤特异性，能调控cd:uprt基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性表达，且其活性较强，与cmv启动子调控的cd:uprt对sgc7901细胞的活性大致相当。 在以htert启动子调控的靶向基因治疗中，人们担心其对体内某些端粒酶表达阳性的正常细胞如生殖细胞、造血干细胞、活化的淋巴细胞的毒副作用。gu等[11]构建了htert启动子调控下的bax基因腺病毒表达载体，并对实验小鼠进行了为期半年的观察，发现小鼠的造血系统及肝脏并无明显异常，同时他们还发现正常人骨髓cd34+造血祖细胞中htert启动子活性很低，接近背景水平，所以认为该系统潜在的干细胞相关毒性有限。kuppuswamy等[12]的研究也证实htert的相关毒性较小。 因此我们认为人端粒酶逆转录酶启动子调控的融合自杀基因系统cd:uprt/5fc能靶向性杀伤胃癌细胞，为胃癌的治疗提供了另一种选择。 【参考文献】 [1] gabi u dachs, joanna tupper, gillian m tozer. from bench to bedside for genedirected enzyme prodrug therapy of cancer [j]. anticancer drugs, 2005, 16(4):349359. 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