内容
【摘要】 目的 观察西地那非抗肿瘤及化疗增效的作用，探讨可能的机制。方法 建立s180小鼠模型。西地那非分低、中、高剂量单独给药或联合化疗。比较抑瘤率；给药第6天流式细胞仪检测中剂量西地那非组、对照组肿瘤细胞凋亡及细胞周期分布，elisa法检测肿瘤细胞内血管内皮生长因子（vegf）、p53、环磷酸腺苷（camp）、环磷酸鸟苷（cgmp）的水平。结果 联合化疗组抑瘤率高于西地那非组，西地那非组又高于对照组；中剂量西地那非组p53、vegf、细胞周期分布与对照组相比无差异，cgmp、细胞凋亡率高于对照组，camp低于对照组。结论 西地那非有一定的抗肿瘤和化疗增效作用；这种作用与诱导肿瘤细胞的凋亡相关，与细胞周期阻滞、vegf、p53的变化无关。 【关键词】 西地那非 凋亡 细胞周期 化疗 0 引言 磷酸二酯酶(pde)通过调节细胞内环磷酸腺苷（camp）、环磷酸鸟苷（cgmp）的浓度在许多生理过程中发挥作用，而camp和cgmp被称为第二信使，对细胞的生长、增殖、分化起重要的调节作用，因此pde常被作为药物的作用靶点[1]。西地那非作为一种选择性的pde抑制剂，目前对它们的研究集中在治疗性功能障碍上，我们以荷s180小鼠为动物模型来研究西地那非的抗肿瘤作用。初步结果显示它有一定的抗肿瘤和化疗增效作用，这种作用与诱导肿瘤细胞的凋亡有关，现报告如下。www.11665.coM 1 材料和方法 1.1 小鼠及分组 昆明鼠，体重（20±2）克，雄、雌并用。按常规方法建立s180小鼠模型。接种瘤细胞24小时后灌胃给药，连续给药10天。随机分组：（1）空白对照组：给予0.2ml生理盐水；（2）环磷酰胺(ctx)组：ctx10mg/（kg·d）。（3）低剂量西地那非组：西地那非30mg/（kg·d）；（4）中剂量西地那非组：西地那非60mg/（kg·d）；（5）高剂量西地那非组：西地那非100mg/（kg·d）；（6）低剂量西地那非联合化疗组：西地那非30mg/（kg·d）＋ctx 10mg/（kg·d）；（7）中剂量西地那非联合化疗组：西地那非60mg/（kg·d）＋ctx10mg/（kg·d）；（8）高剂量西地那非联合化疗组：西地那非100mg/（kg·d）＋ctx10mg/（kg·d）。 1.2 试剂 annexin v试剂盒、elisa试剂盒购自晶美生物工程有限公司。annexin v试剂盒批号：20070216；vegf试剂盒批号：20070105； camp、cgmp试剂盒批号分别为：fhk0152a、fhk0842f；p53试剂盒批号：mca1452。 1.3 标本检测 武汉大学医学生物学结构实验中心完成。 1.3.1 抑瘤率 给药10天，停药24小时后，断椎处死小鼠，称瘤重，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重； 1.3.2 肿瘤细胞凋亡及细胞周期的检测 在给药第6天，取中剂量西地那非组、空白对照组小鼠的肿瘤标本，通过碾磨、离心、过滤等步骤制得单个细胞悬液，按凋亡试剂盒说明进行流式细胞仪（美国beckman公司）检测。 1.3.3 细胞因子浓度的检测 在给药第6天，取中剂量西地那非组、空白对照组小鼠的肿瘤标本，按elisa试剂盒说明进行检测。 1.3.4 电镜检测 在给药第6天，快速取中剂量西地那非组、空白对照组的肿瘤标本少许，常规固定，透射电镜下观察。 1.4 统计学方法 使用spss10.0软件进行统计分析，组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，以p＜0.05判定为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 西地那非对肿瘤的抑制作用及化疗增效作用 表1中低、中、高剂量西地那非组与相应的联合治疗组平均瘤重经t检验，p值分别为0.029、0.003、0.045；ctx组与联合治疗组经t检验，p分别为0.153、0.008、0.011，显示西地那非很好的化疗增效作用。不同剂量西地那非组内、西地那非组与ctx组经方差分析，p均＞0.05，说明西地那非本身有一定的抑瘤作用。表2显示西地那非对小鼠肿瘤的抑制作用无性别差异。 2.2 西地那非对细胞因子浓度及细胞凋亡、周期的影响 结果显示西地那非抗肿瘤作用与改变肿瘤细胞的camp、 cgmp水平，诱导细胞凋亡有关，而与vegf、p53、细胞周期阻滞无关，见表3、4。 表1 西地那非的抑瘤率、化疗增效作用（略） tab 1 effect of sildenafil on anti²tumor and the chemotherapy enhancement 表2 西地那非对雄、雌性小鼠抑瘤作用的比较（略） tab 2 tumor inhibitory effect of sildenafilon male or female mice 2.3 电镜检测结果 空白对照组细胞完整，细胞核居中或偏向一侧，可见核仁；未见明显凋亡特征。西地那非组细胞完整，核固缩，核染色质凝集、周边化，见图1、2。 3 讨论 细胞凋亡是细胞在生理或病理条件下主动启动凋亡基因而发生的一种死亡形式。近年研究证实，许多控制细胞增殖和组织自稳的生理性生长调控机制与凋亡有关，而应用化学药物或γ 射线治疗肿瘤，也主要是通过诱导凋亡而发挥效应[2²3]。由于肿瘤细胞常存在凋亡信号转导途径缺陷，导致许多肿瘤对化疗药物产生耐受[3]。肿瘤细胞凋亡敏感性可能是影响化疗效果的关键因素。因此，提高肿瘤细胞对凋亡的敏感性，能达到化疗增效的目的。 表3 西地那非对细胞因子水平及细胞凋亡的影响（略） tab 3 effect of sildenafil on cytokines and apoptosis vs.control group,★:p=0.267;◆:p=0.592;▲：p=0.001;☆：p=0.018；※：p=0.009 表4 西地那非对肿瘤细胞周期的影响（略） tab 4 effect of sildenafil on tumor cell cycle vs.control group,☆,★,▲:p＞0.05 图1 肿瘤细胞凋亡电镜图像(×3500)（略） 图2 肿瘤细胞电镜图像(×3500)（略） fig 1 the electron microscope image of tumor cell apoptosis(×3500) fig 2 the electron microscope image of tumor cell(×3500) cgmp和camp通过pde水解而失活。西地那非是一种高度选择性的pde5抑制剂，它选择性作用于阴茎海绵体pde5，抑制cgmp的水解，使细胞内cgmp水平升高，增加海绵窦的扩张，从而增强勃起功能。研究发现exisulind通过抑制pde5，引起细胞内cgmp浓度升高，激活蛋白激酶g（pkg）和mekk1²sek1²jnk1下游反应的作用，与紫杉醇联合化疗有增效作用，这种化疗增效作用与诱导肿瘤细胞的凋亡相关[4]。而pde5在许多肿瘤细胞中高表达[5]，这为将西地那非应用于肿瘤治疗提供了可能。 我们以s180小鼠为动物模型，将不同剂量的西地那非作为抗肿瘤药物进行了初步实验，发现30mg/(kg·d)西地那非的抑瘤率达到32.68%，随着剂量的增加，抑瘤率也有进一步的增高。与ctx联合应用时，30mg/(kg·d)西地那非的化疗增敏效果不明显，而60mg/(kg·d)和100mg/(kg·d)西地那非则有明显的化疗增效作用。在相关作用机制的研究中发现，肿瘤细胞内cgmp浓度较对照组升高，camp浓度降低，且比较差异有统计学意义，给药组发生凋亡的细胞比例亦较对照组升高，因此推测西地那非的抗肿瘤及化疗增效作用与药物剂量有一定的量效关系。它的这种作用可能是通过抑制肿瘤细胞pde5，使肿瘤细胞内cgmp浓度升高，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。电镜的结果也进一步证实了肿瘤细胞出现了早期凋亡。结果中肿瘤细胞总的凋亡率不高，这可能与我们的检测时间相关，如果能够在一定的时间内，对凋亡率进行动态检测，就可以发现肿瘤细胞凋亡的高峰期。与对照组相比，给药组肿瘤细胞内p53浓度、细胞周期比例差异无统计学意义，说明诱导凋亡的作用与p53及细胞周期阻滞无关；给药组肿瘤细胞内vegf水平虽然差异无统计学意义，但稍低于对照组，这与曾真等[6]的结果不同，可能与实验中西地那非用药时间较短有关。 【参考文献】 ［1］ li l,yee c,beavo ja.cd3² and cd28² dependent induction of pde7 required for t cell activation[j].science,1999,283(5403):848²851. [2] igney fh,krammer ph.death and anti²death:tumour resistance to apoptosis[j].nature reviews,2002,2(4):277²288. [3] kimr.recent advances in understanding the cell death pathways activated by anti²cancer therapy[j].cancer,2005,103(8):1551²1560. [4] pierson as,gustafson d,long m,et al.a phaseⅰand pharmacologic study of exisulind combined with taxotere in patients with advanced cancer[j].proc am soc clin oncol,2001,20(2):120a. [5] thompson wj,piazza ga,li h,et al.exisulind induction of apoptosis involves guanosine 3',5'²cyclic monophosphate phosphodiesterase inhibition, protein kinase g activation and attenuated ²catenin[j].cancer res,2000,60(13):3338²3342.