内容
作者：黄雅燕，肖美添,叶静,汤须崇
【摘要】 目的 建立快速测定齐墩果酸片含量的方法。方法 采用毛细管电泳法，未涂层弹性石英毛细管（75 μm×50 cm，有效长度40 cm）；压力进样，压力：3.0 kpa；进样时间：5 s；分离电压：25 kv；柱温：25 ℃；检测波长：200 nm；运行缓冲液：含5％（体积分数）甲醇的20 mmol·l-1硼砂溶液(ph 9.4)；运行时间：10 min。结果 齐墩果酸的线性范围为 2.58～660 μg·ml-1（r=0.999 7），平均回收率为99.47%，rsd为1.28% (n=6)。结论 方法准确、快速、简便，适于齐墩果酸片的含量测定。
【关键词】 齐墩果酸片 毛细管电泳 含量测定
abstract:objective to establish an hpce method for rapid monitoring the content of oleanolic acid in oleanolic acid tablets. methods samples were analyzed on a fused and uncoated silic capillary of 75 μm×50 cm (40 cm of effective length). 20 mmol·l-1 of borax containing 5% methanol was used as running buffer. samples were injected hydrodynamically (5 s, 3.0 kpa) into the capillary. the applied voltage was 25 kv and the detection wavelength was set at 200 nm. the temperature was kept at 25 ℃. the running time was 10 min. results the calibration curve was linear in the range of 2.58-660 μg·ml-1(r=0.9997) for oleanolic acid. the average recovery (n=6) was 99.47% with rsd 1.28%. conclusion this method is accurate, rapid, and simple for the content determination of oleanolic acid.
key words: oleanolic acid tablet; hpce; content determination
齐墩果酸片具有护肝降酶、抗炎、强心利尿、抗肿瘤等作用，临床上除广泛应用于急、慢性肝炎的辅助治疗外，也用于配合肿瘤病人的手术、放疗、化疗，促进免疫功能恢复以及再生障碍性贫血、红斑狼疮等免疫缺陷性疾病。WwW.11665.cOm目前国内有许多厂家生产齐墩果酸片，生产上采用酸碱非水滴定法［1］测定其含量，但该方法终点不易掌握，专属性差，误差较大。也有采用比色法［2］、薄层扫描法［3］、hplc法［4］等测定齐墩果酸片的含量，但以上方法均存在费时长、样品用量多、操作繁琐等问题。而毛细管电泳法具有高效、快速、准确、操作简便、样品用量少等优点，适合快速分析样品［5］。笔者采用毛细管电泳测定齐墩果酸片中有效成分的含量，结果方法快速、灵敏、简便、结果准确。
1 仪器与试药 俄罗斯lumex capel105型毛细管电泳仪，紫外检测器，弹性石英毛细管（直径75 μm，总长50 cm，有效长度40 cm，河北永年光导纤维厂）。 齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号：110709200304）；齐墩果酸片（山西亨瑞达制药有限公司，批号：060102、060106、060507、060906，规格为20 mg·片-1）；硼砂（na2b4o7·h2o）、硼酸、乙醇、甲醇、乙腈均为分析纯，实验用水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 分离条件 进样方式，压力进样，压力3.0 kpa，进样5 s；分离电压为25 kv（恒压分析）；柱温25 ℃；紫外检测波长200 nm；以含5％（体积分数）甲醇的20 mmol·l-1 硼砂溶液(ph 9.4)为运行缓冲液。实验前，毛细管依次用0.1 mol·l-1 盐酸、重蒸水、0.1 mol·l-1naoh溶液、重蒸水各冲洗5 min，然后用运行缓冲液冲洗3 min。在每2次运行之间，毛细管用0.1 mol·l-1naoh溶液冲洗2 min，重蒸水和运行缓冲液各冲洗3 min。试验前运行缓冲液用0.22 μm滤膜过滤和超声波脱气。齐墩果酸对照品和齐墩果酸片样品的色谱图见图1。
a.齐墩果酸对照品; b.齐墩果酸片样品; c.阴性样品; 1.齐墩果酸
图1 毛细管电泳图（略）
figure 1 ce chromatograms
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品储备液的制备 精密称取齐墩果酸对照品6.6 mg于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，以0.22 μm滤膜过滤，即得。
2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品20片精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于齐墩果酸20 mg)置100 ml量瓶中，加甲醇约60 ml，超声30 min，放冷，加甲醇定容刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。实验前样品溶液经0.22 μm滤膜过滤，备用。
2.3 线性关系 精密量取不同体积“2.2.1”项下的齐墩果酸对照品储备液，分别加甲醇制得质量浓度为2.58、10.3、41.2、82.5、165、330、660 μg·ml-1的一系列对照品溶液，进样测定，以峰面积积分值（a）为纵坐标，质量浓度（ρ）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：a=0.3523ρ+0.275，r=0.999 7。表明齐墩果酸在2.58～660 μg·ml-1范围内具有良好的线性关系。 2.4 精密度试验 取质量浓度330 μg·ml-1齐墩果酸对照品溶液连续进样6次，结果峰面积积分值的rsd为0.58％，表明精密度良好。
2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、4、8、24、72 h进样，记录色谱图，结果峰面积积分值的rsd为0.79%，表明样品溶液在72 h内稳定。
2.6 重复性试验 取同一批号（060106）样品，照“2.2.2”项下的方法制备6份供试品溶液，依上述色谱条件测定含量，结果齐墩果酸平均含量为标示量的97.8%，rsd为0.57%，表明方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验 精密称取6份已知含量的供试品细粉适量(相当于齐墩果酸10 mg)，加入齐墩果酸对照品约9.5 mg，按“2.2.2”项下的方法制备溶液，进样测定，计算回收率，结果齐墩果酸的平均加样回收率为99.47% (n=6)，rsd为1.28%,见表1。
2.8 最低检出限和定量限 当信噪比为3时，最低检出限为0.13 μg·ml-1；当信噪比为10时，定量限为0.52 μg·ml-1。
2.9 样品测定 取3个不同批号（060102、060507、060906）的齐墩果酸片，按“2.2.2”项下方法制备溶液，依上述色谱条件进样测定，3批样品的测定结果分别为标示量的97.0%、99.4%、96.8%（n=3)。
表1 回收率试验结果（略）
table 1 results of recovery(n=6)
3 讨论
3.1 比较了磷酸盐、磷酸盐硼砂、硼砂硼酸等多种缓冲体系及其浓度对分离效果的影响。结果发现，20 mmol·l-1的硼砂缓冲溶液体系，电泳电流较小，基线平稳，齐墩果酸出峰快(4.10 min)，信号灵敏度高。故选择20 mmol·l-1的硼砂（ph 9.4）作为背景电解质溶液比较理想。
3.2 为改善峰形和提高检测灵敏度，实验添加了适量的有机溶剂。比较了添加不同有机溶剂种类(甲醇、乙醇、乙腈)及体积比例对分离检测的影响。结果表明选用体积分数为5.0％甲醇作为添加剂可有效提高分离度和灵敏度。
3.3 齐墩果酸片收载于《卫生部药品标准》二部第三册，含量测定采用酸碱滴定法，用乙醇制氢氧化钾滴定液，其配制较繁琐，测定终点不明显；采用hplcuv检测时，由于齐墩果酸为五环三萜类成分，在200 nm处有末端吸收，测定结果受流动相影响大，基线不理想，检测灵敏度较低；毛细管电泳具有快速、准确、操作简便、样品用量少等优势，本实验中，样品的测定在5 min内就能完成，且能克服hplc法紫外末端检测的不足。
3.4 本实验同时采用卫生部药品标准收载的酸碱滴定法和hplcuv法测定3批样品中的齐墩果酸含量，测得的结果分别为100.6%、102.0%、99.3%和96.9%、99.9%、96.2%。说明酸碱滴定法测定的结果偏高，毛细管电泳法测定的结果与hplc法测定的结果接近，表明本方法的准确性可靠。
【参考文献】 ［1］ 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准二部：3册［m］.北京：化学工业出版社，1994：19. ［2］ 邓世星,孙志勇,周卿,等.紫外光谱法测定齐墩果酸含量［j］.遵义医学院学报，2003,26(6): 556-557. ［3］ 都述虎,饶金华,耿武松.薄层扫描法测定木瓜中齐墩果酸的含量［j］.中草药，2003,34(1):35-37. ［4］ 罗朝晖.高效液相色谱法测定三叶香茶菜中齐墩果酸的含量［j］.时珍国医国药，2007,18(2): 417-418. ［5］ 张锋，朱培仪，宋粉云.毛细管电泳高频电导法测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量［j］.广东药学院学报，2008，24（2）：108-109.