内容
作者：徐伟，张淑玲，洪振丰，郑海音
【摘要】 目的 研究ab8大孔树脂分离纯化龙须藤黄酮的工艺条件。方法 通过静态吸附解吸附实验筛选最佳大孔树脂，并以总黄酮含量为考核指标，采用l9（34）正交试验法对影响ab8大孔树脂分离纯化龙须藤黄酮的因素进行考察，确定最佳工艺条件。结果 最佳工艺条件为：采用ab8型大孔树脂，取龙须藤黄酮提取液(含生药0.5 g/ml)上样，树脂用量为4倍生药量，洗脱剂采用体积分数50％乙醇，用量为16倍生药量。结论 该工艺条件科学合理，可有效地用于龙须藤黄酮的分离富集。
【关键词】 龙须藤 大孔树脂 正交设计法 总黄酮 abstract:objective to optimize the separation and purification procedure of total flavonoids from bauhinia championii benth by ab8 macroporus resin. methods the yield of total flavonoids was used as a maker. the static and dynamic adsorption/desorption methods and orthogonal design l9（34）were used to evaluate factors such as concentration of alcohol，ratio of alcohol to raw material and ratio of resin to raw material. the content of total flavonoids was determined by uvvis spectrophotometer. results the optimum conditions were as following: ratio of resin to raw material was 4, 50% of alcohol was used for eluent, ratio of alcohol to raw material was 16. conclusion this procedure is reasonable, which could be used to separate and purify the total flavonoids from bauhinia championii benth.
key words:bauhinia championii benth；macroporus resin；orthogonal test；total flavonoids
龙须藤 (bauhinia championii benth.)为双子叶植物豆科羊蹄甲属植物多年生藤，具有祛风湿、行血气的功效。wWW.11665.CoM文献研究表明龙须藤具有镇痛抗炎、抗风湿骨痛、抗血小板凝集等药理作用，主要含有黄酮、氰苷、没食子酸等成分［1］。其中黄酮类是主要有效成分，具有较强的镇痛抗炎［2］、抗血小板凝集［3］等活性。大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂，兼具吸附和分子筛分离原理，对有机化合物具有良好的吸附分离性能。本文采用静态吸附解吸实验，筛选最佳大孔树脂，利用正交试验法对大孔树脂分离纯化龙须藤黄酮的主要影响因素进行考察，优化树脂分离工艺参数，为开发利用龙须藤黄酮提供实验依据。
1 仪器与试药 wfz800d3b紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；kq2500b超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，bs200s电子天平（赛多利斯公司）。龙须藤采集于福建永泰县青云山地区，由福建中医学院药学系鉴定为豆科羊蹄甲属植物龙须藤(bauhinia championii benth.)的藤。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号100080200306)，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 龙须藤黄酮的提取［4］ 取粉碎过筛的龙须藤药材适量，加10倍(生药量)的体积分数60％乙醇浸泡3 h，回流提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，回收至无醇味，加水溶解至每1 ml含0.5 g生药，离心(4 000 r/min )15 min，过滤，备用。测得总黄酮质量分数为6.91％。
2.2 总黄酮含量测定［4］
2.2.1 标准曲线绘制 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品23.0 mg,置50 ml量瓶中，加体积分数95%乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分别置25 ml量瓶中，加水至6.0 ml；加入5% nano2溶液1.0 ml，使混匀，放置6 min；加入10% al(no3)3 1.0 ml，摇匀，放置6 min；再加入4％naoh溶液10.0 ml，加水至刻度，摇匀，放置15 min，于500 nm波长处测定吸光度。以吸光度（a）对质量浓度(ρ)进行线性回归，得回归方程：a=0.0055ρ+0.024,r=0.999 87，表明芦丁对照品质量浓度在18.40～110.4 μg/ml范围内线性关系良好。
2.2.2 样品含量测定 龙须藤洗净，晾干，置恒温干燥箱中于75 ℃下干燥8 h，取出粉碎，过筛(20目)，所得粉末干燥保存备用。按下述试验条件回流提取后，将粗提取液过滤，浓缩，放置冷却后定容于100 ml量瓶中。精密吸取样品溶液1.0 ml置10 ml量瓶中，再精密吸取溶液1.0 ml，按“2.2.1”项下方法，自“加水至6.0 ml”起依法测定吸光度，代入回归方程计算出样品溶液中总黄酮的提取率（总黄酮提取率＝总黄酮质量/龙须藤质量×100％）。
2.3 大孔树脂的筛选 选择4种极性、孔径、比表面等参数不同的大孔树脂(da101、ab8、hp20和h103)，分别用静态吸附法和静态解吸法测定其吸附与解吸性能，以确定实验用树脂。
2.3.1 大孔树脂预处理 称取上述4种树脂适量，用乙醇浸泡树脂24 h后，分别上柱进行预处理，用体积分数95％乙醇流动清洗，检查流出的乙醇液至乙醇液与水1∶5混合不呈白色混浊为止，然后以大量蒸馏水冲洗，至水洗液无醇味为止。
2.3.2 静态吸附实验 称取4种处理好的大孔树脂(da101，ab8，hp20，h103)2 g，分别加入龙须藤黄酮提取液10 ml置25 ml三角瓶中，每间隔10 min振荡1次，持续4 h后，静置24 h，使达到饱和吸附，过滤，测定滤液中黄酮含量，按［吸附率=(初始浓度-吸附后浓度)／初始浓度×100％］计算吸附率，结果见表1。
2.3.3 静态解吸实验 将静态吸附后的树脂过滤抽干，各加入体积分数50％乙醇20 ml，每间隔10 min振摇1次，持续4 h后，静置24 h。测定洗脱液中龙须藤黄酮的含量，按［解吸率=(洗脱液浓度×洗脱液体积)/(初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积×100％］计算解吸率，结果见表1。 表1 树脂对龙须藤黄酮的吸附率和解吸率（略） table 1 static and dynamic adsorption/desorption of total flavonoids
比较各种树脂的吸附率和解吸率，综合分析，以ab8型大孔树脂对龙须藤黄酮的吸附分离效果较佳，故选择ab8大孔树脂作为实验用树脂。
2.4 大孔树脂纯化工艺研究
2.4.1 正交试验［5］ 采用ab8型大孔树脂对龙须藤黄酮提取液进行分离纯化，对树脂分离纯化过程中的主要因素如大孔树脂用量、洗脱剂(乙醇)浓度、乙醇用量等进行考察，因素水平表见表2，正交试验结果见表3。
2.4.2 结果分析 以总黄酮质量分数为考察指标进行直观分析和方差分析，结果见表3和表4。可见各因素影响程度大小为c b a，其中c因素(树脂用量)有显著影响，a2b3c3为各因素的最佳水平，确定a2b3c3为较优树脂纯化工艺条件，即采用ab8型大孔树脂，树脂用量为4倍生药量，洗脱剂采用体积分数50％乙醇，洗脱剂用量为16倍生药量。
2.4.3 验证试验 取龙须藤黄酮提取液，按照a2b3c3条件重复3次，结果3批样品中黄酮平均质量分数为5.25％，从提取液中的转移率为83.67％，表明该工艺条件合理，能较大程度地分离富集龙须藤黄酮。
表2 因素水平表（略）
table 2 factors and levels
表3 正交试验结果（略）
table 3 result of orthogonal experiment
表4 方差分析结果（略）
table 4 variance analysis results
3 讨论 大孔树脂是一种多孔性高分子材料，具有多孔性和较大的比表面积，主要通过物理作用从溶液中有选择性地吸附有机物质，从而达到分离纯化的目的。ab8为聚苯乙烯型非极性吸附树脂，表面有一定的酯基，亲水性得到改善，但吸附机理仍为疏水性吸附。该树脂的比表面积和孔径较大，适合于吸附具有一定疏水性的中药成分，吸附量较大，洗脱容易，吸附动力学性能良好。对热、有机溶剂和一般使用条件下的酸、碱稳定，使用寿命较长。对蛋白、糖类、无机酸、碱、盐、小分子亲水性有机物均不吸附，因而可将一般中药成分与这些物质分离。 通过正交试验筛选得到龙须藤黄酮的分离纯化条件：采用ab8型大孔树脂，取龙须藤黄酮提取液(含生药0.5 ml)上样，树脂用量为4倍生药量，洗脱剂采用体积分数50％乙醇，用量为16倍生药量。实验表明该法可有效地从龙须藤提取液中富集分离黄酮类有效成分。实验中对龙须藤黄酮的含量测定方法进行了方法学考察，结果表明精密度、重复性、回收率均符合要求，在2 h内显色基本稳定。
【参考文献】 ［1］ 白海云，詹庆丰，夏增华，等.九龙藤化学成分研究［j］.中国中药杂志，2005，30(1)：42-43. ［2］ 洪振丰，徐伟，郑海音，等.康美肤烧伤膏的抗炎和镇痛实验研究［j］.中国中医药科技，2007，14（6）：410-411. ［3］ 胡娟，叶蕻芝，冯亚，等.3种闽产中药体外对大鼠血小板凝集的影响［j］.福建中医学院学报，2007，17（3）：23-26. ［4］ 徐伟，洪振丰，王瑞国.龙须藤中黄酮类化合物提取条件的研究［j］.广东药学院学报,2006，22（6）：596-597. ［5］ liu huoan，wang bochu，dai chuanyun，et al. optimization of preparative separation and purification of total flavonoids from radix puerariae by macroporous resin method［j］．j chn pharmaceut sci，2006，15(2)：121-126．