内容
【关键词】 大鼠 发热模型 发热机制
发热是多种疾病进展过程中重要的临床表现之一，其中以细菌引起的感染性发热最常见，其次为病毒等，与发热有关的动物模型建立可为探讨发热的原因及病理生理学提供重要的平台。本文将大鼠发热原因、发热模型以及发热时体温调节介质的研究进展做一综述。
1 发热的原因
发热过程大体可分为以下几个阶段：外源性致热原(exogenous pyrogen)进入机体，作用于巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞等免疫活性细胞，产生内源性致热原(endogenous pyrogen，ep)，即大量致热性细胞因子，这些细胞因子直接或间接通过中枢介质作用于体温调节中枢，体温调定点上移，引起产热增加，散热减少，使体温在一个新的调定点达到平衡[1]。
1.1 外源性致热原
是指能激活致热原细胞产生和释放致热性细胞因子的物质，又称为发热激活物(ep诱导物)。主要有:
1.1.1 微生物性发热激活物[2] ①革兰阳性菌：是常见的发热原因。主要有葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、白喉杆菌等,包括外毒素和肽聚糖。②革兰阴性菌：大肠埃希氏菌、伤寒杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌等,这类菌致热性除含有肽聚糖外,最主要的致热性成分是脂多糖,也称内毒素(et)。内毒素是最常见的外致热原,耐热性高(干热160 ℃ 2 h才能灭活),可刺激致热性细胞产生和释放内生性致热原引起发热。wWW.11665.COm③病毒：常见有流感病毒、麻疹病毒等,病毒致热成分是病毒体和其所含的血细胞凝集素。④真菌：真菌引起致热作用是菌体及所含荚膜多糖和蛋白质,常见真菌有白色念珠菌、组织胞浆菌、新型隐球菌等。
1.1.2 非微生物发热激活物 抗原抗体复合物对产ep细胞有激活作用,许多自身免疫性疾病都有顽固性发热,如系统红斑狼疮、类风湿、皮肌炎等,循环中持续存在抗原抗体复合物可能是其主要的发热激活物[2]。
1.2 内生性致热原
主要是一些是由免疫细胞和部分非免疫细胞合成和释放的细胞因子,具有细胞间信息传递、免疫调节作用的一大类小分子蛋白质或多肽。其中部分细胞因子与发热反应关系密切,在发热中起重要作用。众多的研究发现，与发热有关的细胞因子主要有以下几种:白介素1家族(il1)及il1受体拮抗蛋白(il1ra)、肿瘤坏死因子α(tnfα)、白介素6(il6)、干扰素(ifnα)。这些细胞因子及其受体之间相互联系、相互影响，作用于全身和局部从而参与发热反应，介导炎症过程，参与免疫调节，影响组织代谢等生物效应。当病原(内毒素或病毒)侵犯机体后，可引起特定方式的致热因子释放，致热细胞因子之间相互调节，最后识别靶细胞受体，尤其是下丘脑视前叶区的神经细胞,受介导活化磷脂酶a，并以花生四烯酸为底物激活环氧化酶通路[3]。
1.2.1 白介素1家族(il1)及il1受体拮抗蛋白(il1ra)
实验证实,il1 尤其il1β是参与多种致热原性发热的重要细胞因子[4]。对于小剂量lps(100 μg/kg,ip) 诱导的发热,conti b等[5]实验结果显示,lps导致发热反应的第一步是释放前炎症细胞因子，如白细胞介素(il1)和(il6) ，介导细胞因子对神经元的下丘脑视前区的发热。steiner [6]等在实验中预先给予il1ra或使il1ra在体内过度表达均可减轻il1β引起的发热,延迟发热时间,并提高对il1β、il1α的耐受性,而皮下注射lps引起局部il1β、il1α浓度升高,2 h后il1ra水平升高,且il1ra的浓度与发热程度呈负相关。由此可知,il1ra是重要的内源性il1拮抗剂,具有限制发热的作用。
1.2.2 肿瘤坏死因子α(tnfα) tnfα是重要的内生性致热原之一,tnfα 是在lps诱导下最早出现的、生物活性广泛而强烈的一种细胞因子，是lps诱导的细胞因子网络的始动因子。lps是目前已知的诱导tnfα最强、最有效的激活物之一，25～50 μg/l的lps即可以使新鲜人血中的单核细胞生成tnfα。tnfα可由细菌、病毒、真菌或寄生虫等激活体内多种细胞产生(如巨噬细胞、淋巴细胞)，在体液中出现高峰水平的时间较早，是介导炎症反应的主要细胞因子，被称为“广谱炎性介质”,不仅参与炎症反应过程，而且还与其他炎性介质组成复杂的网络系统，通过相互诱生而互相影响生物学效应，使机体出现多种病理损害，而且在体内的峰值出现越早、浓度越高则损害越严重[7]。tnfα具有广泛的生物活性，在许多疾病的发生发展中起着重要的作用。有研究表明[8],tnfα具有致热性,能使体温至少升高2 ℃，由感染、肿瘤、系统性红斑狼疮等导致的长期发热患者血清中tnfα含量均明显高于正常人，而细菌性感染患者血清tnfα水平显著高于非细菌性感染患者。
1.2.3 干扰素(ifnα)
ifnα是一种具有抗病毒、抗肿瘤作用的蛋白质,主要由白细胞产生,具有一定的致热效应。不耐热,60 ℃时40 min可灭活,目前认为是内生性致热原之一。干扰素是一种糖蛋白,肌肉注射吸收率在80%以上,其发热反应与干扰素诱导内源性致热源物质(如前列腺合成酶)有关。研究表明[9],ifnα致热经pge2途径介导，故推测avp参与ifnα性发热反应的调节。关于ifnα性发热能否引起vsa中avp含量升高尚未见报道。
2 发热模型
动物发热模型的建立方法有很多种，最常见的主要是采用向动物体内注入脂多糖(lps)、2,4二硝基酚和酵母菌的方法制作发热模型。
2.1 脂多糖(1ipopo1ysaccharide，lps)诱导的发热模型
lps是革兰阴性细菌内毒的活性成分，lps有高度水溶性，是效应很强的细菌致热源。lps 由3个成分组成,最外层为特异性多糖,即菌体多糖,它是由几个单糖组成的许多个同样的重复单位连接而成,与细菌的侵袭力有关;中间是核心多糖(同一种属之间是相同的);内层是类脂a,它是一种特殊的糖磷脂,主要起毒性作用而无种属特异性[10]。其诱导的发热表现为双相热或三相热,并伴有寒颤、精神萎靡和轻微腹泻等症状,与临床感染性炎症所致发热相似,是经典的炎性发热模型,常用于筛选解热药物并探讨炎性发热机制。因为该模型具有自限性和耐受性,如在用于中药解热药效(一般起效较慢)的研究时，应在用lps诱导发热之前即开始给药。lps诱导发热模型所用的剂量范围较大,从10～250 μg/kg 不等,其中较为常用的剂量是10 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg。在探索lps诱导大鼠发热的最佳剂量时,发现引起实验大鼠发热热势高、持续时间长的lps 剂量为20 μg/kg[11]。
lps诱导的大鼠发热模型的具体操作方法是先每日测量大鼠体温(肛温)2次,连续2日,取2次体温的平均值记为基础体温。单次体温超过38 ℃或2次体温差超过0.5 ℃的动物剔除。实验前6 h 禁食不禁水。然后腹腔注射lps(20 μg/kg 或80 μg/kg),诱发动物发热,注射lps后每隔0.5 h 测1次体温,连续监测8 h。
2.2 2,4-二硝基酚诱导的发热模型
2,4-二硝基酚可刺激细胞氧化过程，抑制磷酰化过程，使氧化过程受到刺激所增加的能量不能通过磷酰化转变为三磷酸腺苷或磷酸肌酸的形式贮存而以热能散发，引起发热。2,4二硝基酚用于制作动物发热模型时，所使用的实验动物多为大鼠或家兔。有实验表明[12]，2,4二硝基酚诱导的发热模型升温后持续时间较短,大约1 h左右,所以不适用于作用缓慢而持久的解热药物解热作用的考察，但对于作用快速且强大的药物,实验结果满意。
2,4二硝基酚诱导的大鼠发热模型的具体操作方法[13]：致热前用肛温计测量大鼠直肠温度1次，连续3 d，取其平均值作为正常基础体温。测量时将大鼠仰位固定于鼠板上，待其稳定后，在肛温计顶端涂少许凡士林油，轻缓送入肛门2 cm，放置3 min后取出读数。选正常体温在36.6～38.3 ℃的正常大鼠，然后在各鼠背部皮下注射2,4二硝基酚15 mg/kg，每隔0.5 h测量体温。
2.3 酵母菌诱导的发热模型
酵母菌属真菌类,经高压或甲醛杀死的酵母细胞与活细胞一样也可引起发热,其致热成分是全菌体及菌体内所含的荚膜多糖和蛋白质。酵母菌作用于机体后,可激活ep细胞产生和释放ep,后者作用于体温调节中枢,引起发热介质的释放,继而改变调定点。有研究表明[14]，酵母致大鼠发热与体温调节中枢发热介质5ht含量变化有关，下丘脑组织中5ht含量随体温的改变而改变。酵母菌所致的发热是由注射部位的局部溃烂引发的剧烈炎症反应导致，动物全身表现与临床伴内脏或皮肤有明显炎症的里热证类似，更适合考察清热药的解热作用。另有研究表明[15]，干酵母混悬液皮下注射于大鼠后,先引起动物体温下降,一段时间后动物体温明显升高,并持续较长时间,而且局部有明显炎症症状出现。
酵母菌诱导的大鼠发热模型的具体操作方法：将干酵母用生理盐水配成15%的混悬液,按5 ml/kg的剂量皮下注射给sd大鼠。在正式实验前1周,每天3次(早、中、晚各1 次)对大鼠的直肠进行刺激。正式实验时,0.5 h 内测定大鼠体温3 次,取其均值作为基础体温值,皮下注射干酵母混悬液后,每小时测体温1 次。 2.4 其他诱导的发热模型
在诱导的大鼠发热模型中，除了以上3种主要的模型外，还有一些其他模型，虽然使用不是那么的普遍，但在特定的实验、特定的情况中也有用到。
2.4.1 角叉菜的致热模型 角叉菜诱导发热模型的特点是致炎局部的前列腺素合成增加，并与血管活性物质和激肽类一起诱发水肿，常用于观察药物对急性炎症过程的影响，它是筛选发热抗炎药物的常规模型[16]。李茂等在研究中发现舒感颗粒对角叉菜胶引起的大鼠发热具有一定的解热作用，流感病毒引起的发热有标本兼治的功效[17]。该方法造模导致的发热常常以局部急性炎症为主要表现，因此一般用于致炎实验，而鲜用于制作发热模型。
2.4.2 注射杀死的大肠杆菌或乙型副伤寒杆菌培养液 将在30～37 ℃培养3～4周的大肠杆菌肉汤培养液或培养3～4昼夜的乙型副伤寒杆菌肉汤培养液，以细菌滤过器过滤。把留在滤器上的细菌剩余物放入盛有甘油1～2 ml的研钵中研碎，高压灭菌。取该混悬液0.2 ml，以过滤液(肉汤)2 ml稀释后，给大鼠皮下注射，几小时内即可引起发热，此法可以使发热持续较长时间，大约在12 h左右[18]。
3 与发热有关体温调节介质
体温调节的高级中枢主要位于视前区下丘脑前部(poah),该区含有温度敏感神经元,对来自外周和深部温度信息起整合作用,将致热原或发热介质微量注射于poah可引起明显的发热反应;另一些部位如杏仁核(man) [19]、腹中膈(vsa)和弓状核则对发热时体温产生负向影响,刺激这些部位可使体温上升超过正常时难以逾越的界限,因此发热时体温可能由两种介质相互作用进行调节:一个是正调节介质,使体温上升,主要包括环磷酸腺苷(camp)、前列腺素e2(pge2)、氧化亚氮(no)等;另一个是负调节介质,促使体温下降,主要包括精氨酸加压素(avp)。当外周致热信号通过这些途径传入中枢后,启动体温正负调节机制,正负调节相互作用的结果决定调定点上移水平和发热的幅度[19]。
3.1 正调节介质
3.1.1 环磷酸腺苷(camp) camp作为一种重要的中枢发热介质已受到国内外学者的一致认同。camp是接近体温调节终末环节的发热介质,大多数学者认为“na+/ca2+上升诱导下丘脑内camp的含量上升”是多种致热原引起发热的共同中介环节[20]。发热动物模型脑脊液及下丘脑组织中,camp 含量增多与体温升高呈显著正相关[21]。
3.1.2 前列腺素e2(pge2) 致热原引起发热时，脑脊液中pge2含量明显增加，并且pge2含量升高先于体温升高，起始于发热的潜伏期并持续发热的全过程[22]。动物侧脑室注入微量的pge2可诱导发热反应,并且pge2可直接刺激po/ah区温度敏感神经元,改变其放电频率。中枢内pge2主要来源于脑血管内皮细胞及其周围的巨噬细胞，并以旁分泌形式作用于下丘脑温度敏感神经元的pge2受体,有学者对pge2受体后续的信号转导通路进行了研究，认为pge2与ep结合后，通过提高细胞内的camp使调定点升高[23]。
3.1.3 氧化亚氮(no) 氧化亚氮作为一种新型的神经递质,广泛分布于大脑皮层、小脑、下丘脑视上核、室旁核、视前区下丘脑前部(poah)等部位。外周及中枢no参与了多种动物的体温调节过程,并可能通过与中枢环氧合酶——前列腺素e(coxpge)系统相互作用参与了酵母性发热。对于大鼠,外周给予nos抑制剂可降低甚至完全阻断lps、il1等致热原诱导的发热及应激性体温升高,但大剂量也可使正常动物出现类似发热反应; 在中枢,no供体可加强大鼠发热反应,但外周应用no则可显著降低发热及正常大鼠体核温度，这些均说明no参与了大鼠体温调节过程。总的来说,大鼠体温对于no的反应,实际上可看作中枢和外周作用的叠加或整合[24]。
3.2 负调节介质
在负反馈调控中,脑内生成一些内源性降温物质可能起着主要的作用,这些对抗体温升高或降低体温的物质中,现阶段研究最多的是精氨酸加压素(avp)。avp是一种9肽神经递质，分布于cns的细胞体、轴突和神经末梢，包括其作用部位腹中膈区(vsa)和中杏仁核的神经末梢，机体发热时其含量增多。众多研究表明[25],avp 具有明显的抑热作用,avp被认为是一种内源性解热物质。其在中枢作用于vsa 的v1亚型受体发挥解热或限热作用。有学者认为[26]avp可能是通过影响位于poah 区的温度敏感神经元的放电频率而影响体温，vsa中avp含量下降,表明avp释放增多,刺激avp的内源性释放可抑制发热。
4 展 望
目前制作大鼠发热模型主要还是以采用酵母、内毒素(lps)和2,4二硝基酚最为常见，其共同的特点是造模方便，成功率高，对实验条件要求也比较低。lps诱导发热起效较慢，宜较早给药，其诱导的发热表现为双相热或三相热,并伴有寒颤、精神萎靡和轻微腹泻等症状,与临床感染性炎症所致发热相似,是经典的炎性发热模型,常用于筛选解热药物并探讨炎性发热机制。2,4二硝基酚诱导的发热模型升温后持续时间较短,大约1 h左右,所以不适用于作用缓慢而持久的解热药物解热作用的考察。但对于作用快速且强大的药物,效果还是很理想。酵母菌所致的发热是由注射部位的局部溃烂引发的剧烈炎症反应导致，动物全身表现与临床伴见明显炎症的里热证类似，更适合考察清热药的解热作用。
给动物注射菌液或内毒素时，注射量并不与发热反应强度呈正比。注入量过大时体温可不上升，故剂量的选择必须恰到好处。静注菌液或内毒素等引起的发热较皮下注射迅速而强烈。但注射化学刺激则必须皮下注射才会引起较强反应。可能是该类物质刺激皮下组织造成无菌性炎症所致。此外，动物种族，年龄和形态特性对发热也有明显的影响。实验室的温度能明显的影响发热反应速度和强度，因此，在进行实验时使室温保持在偏低水平(20～25 ℃)为宜。
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