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食管鳞癌中tgf 【关键词】 食管肿瘤；癌,鳞状细胞；转化生长因子β;,,endoglin；新生血管化,病理性 【abstract】 aim: to investigate the expressions of tgfβ and endoglin/cd105 in esophageal carcinoma from patients in high incidence area in north china. methods: the expressions of tgfβ and endoglin/cd105 mrna and protein were detected in 30 esophageal carcinoma samples using rnase protection assay and immunohistochemical staining. results: tgfβ1, tgfβ3 and endoglin/cd105 mrna, other than tgfβ2, were significantly increased in esophageal carcinoma than those of adjacent noncancerous tissue(p 0.05). there was a significant correlation between tgfβ3 and endoglin/cd105 at mrna level. conclusion: the overexpressions of tgfβ1, tgfβ3 and endoglin/cd105 may be involved in the regulation of angiogenesis in esophageal carcinoma. endoglin/cd105 is an important angiogenesis marker as well as regulatory component on cell membrane in regulating the biological function of tgfβ. endoglin/cd105 could be a potential target to antiangiogenesis therapy. 【keywords】 esophageal neoplasms; carcinoma, squamous cell; transforming growth factor beta; endoglin; neovascularization, pathologic 【摘要】 目的： 研究食管鳞癌中tgfβ和endoglin/cd105的表达及在血管生成中的作用. 方法： 采用rna酶保护性分析和免疫组织化学方法对30例食管癌高发区食管癌患者的癌组织和癌旁组织tgfβ和endoglin/cd105 mrna和蛋白表达水平进行检测. 结果： 食管癌组织中tgfβ1和tgfβ3 mrna较癌旁组织显著增高(p＜0.05)，tgfβ2无变化. 食管癌组织中endoglin/cd105 mrna较癌旁组织也显著升高(p＜0.05). tgfβ3 mrna与endoglin/cd105 mrna的相关分析显示有相关关系. 结论： tgfβ和endoglin/cd105参与了食管鳞癌血管生成过程的调节， endoglin/cd105不仅是细胞膜上tgfβ受体中调节tgfβ生物学功能的一个重要分子，而且是新生血管的重要标志. 因此调节endoglin/cd105的功能可能成为抗血管治疗中的一个潜在的、具有较宽生物防治谱的靶点. 【关键词】 食管肿瘤；癌，鳞状细胞；转化生长因子β; endoglin；新生血管化，病理性 tgfβ是一类多功能细胞因子，参与多种细胞功能的调节，包括细胞增殖、分化、迁移、细胞外基质的合成等［1］. tgfβ是mr 25 000的二聚体，哺乳动物细胞中包括三种亚型： tgfβ1， tgfβ2， tgfβ3. tgfβ1在细胞生长过程中的作用较为复杂，研究显示在不同细胞类型和/或不同阶段可促进或抑制细胞生长［2］, 在多种（尤其是上皮源性）非恶性细胞中，它通过诱导细胞凋亡和/或通过上调细胞周期依赖抑制因子（p15，p21和p27）的水平将细胞阻滞在g1期从而抑制细胞的生长［2-4］. 由于恶性肿瘤细胞常存在tgfβ受体的丢失、突变和/或缺陷而对tgfβ1生长抑制作用产生抗性［2］，此外，tgfβ1可通过刺激肿瘤血管生成，细胞外基质重塑及抑制机体对肿瘤细胞的免疫反应等多种途径促进肿瘤的生长［2,5］. 本研究对食管癌高发区食管癌患者癌组织中tgfβ和其受体调节分子endoglin mrna 进行检测并探讨其在血管生成中的作用. 1对象和方法 1.1对象30例食管癌标本来自食管癌高发区河南省林州市人民医院199903~05间手术患者. 术中切除的食管癌标本迅速放入液氮中储存备用. 其中男17例，女13例，年龄43~71（平均56±9）岁. 病理学检查均为食管鳞状上皮细胞癌，其中高中分化20例，低分化10例. 1.2方法 1.2.1rna提取和多探针rna酶保护性分析根据以往描述的方法［6］，对食管癌标本进行多部位取材，在低温下研碎后采用trireagent（美国mrc公司产品）提取总rna，分光光度计（pharmaciabiotech）检测rna浓度，以30 μg分装备用. 采用多探针rna酶保护性分析试剂盒（美国pharmingen产品），以hck3为多探针模板（包括tgfβ1, tgfβ2, tgfβ3）根据产品说明进行操作. 采用cyclone phosphorimager（美国hp公司产品）对mrna表达进行定量分析. 看家基因l32作为内参照以确定rna的上样量，每例标本尽量重复多次，以减少误差，部分标本因为rna量不足，只做1次，如图1中病例8的癌旁组织和病例9的癌组织. 1.2.2肿瘤组织中血管的组织化学染色及定量分析食管癌cd105 免疫组织化学染色及定量分析采用fenton 等［7］的方法. ① 冰冻组织切片:新鲜标本用oct 包埋后,4~5 μm 连续切片,尽量避开出血坏死区. 30 例新鲜组织冰冻切片后,丙酮固定10 min,空气中干燥10min后备用. ② 血管的组织化学染色(cd105) 方法: pbs洗10 min×1 , 5 min×1; 50 ml/l正常血清封闭30 min，pbs 洗5 min×3; 30 ml/l双氧水5 min, pbs 洗5 min×3; cd105 (1∶100) 孵育过夜; pbs 洗5 min×3; hrp 标记的羊抗兔抗体(1∶25) 孵育1 h, pbs 洗 5 min×3; aec显色40 min，置于pbs 中. ③ 肿瘤血管的定量分析:在显微镜下采用sony自动数码成像系统(3ccd型) 对每一例肿瘤组织随机选取起始点连续采集16个200×高倍视野形成一张完整肿瘤血管图片(总面积为1514 mm2) 用于定量分析. 采用商用imageproplus 软件对血管进行定量分析,其原理为计算机随机选取多个点以测量随机点与血管的平均距离(以μm为单位) ,因此血管平均距离越小,血管密度越高. 统计学处理： 数据以x±s表示，使用spss10.0软件进行统计分析，食管癌组织及癌旁组织mrna分析采用配对资料t检验，相关分析采用直线相关分析计算相关系数，检验采用pearson检验. p 0.05为有统计学意义. 2结果 2.1tgfβ mrna表达水平检测tgfβ mrna表达水平见图1，其量化结果见表1. 其中tgfβ1，tgfβ3在食管癌组织中的mrna较癌旁组织明显增高（p＜0.05）, tgfβ2与癌旁组织中相比无变化. 图1rna酶保护试验检测食管鳞癌和癌旁组织转化生长因子mrna表达情况 图1中显示病例69的tgfβ1, β2, β3的mrna表达，n表示癌旁组织，t表示肿瘤组织，定量分析以l32作为内参照.表1原发性食管鳞癌tgfβ mrna表达情况 2.2食管鳞癌组织endoglin mrna及蛋白检测对endoglin mrna的定量分析［8］显示食管癌组织中endoglin (69.3±3.9)较癌旁组织(89.1±7.4)显著升高(p 0.05). 采用免疫组织化学方法对肿瘤组织中endoglin/cd105染色，如图2所示，endoglin/cd105分布于间质血管，阳性血管呈紫红色（aec显色），而肿瘤细胞仅有轻微着色，对阳性血管定量分析显示食管癌组织中endoglin/cd105染色的血管平均距离（密度）为（50.4±18.4） μm. 2.3tgfβ和endoglin的相关性分析tgfβ3 mrna与endoglin/cd105 mrna的相关分析显示有相关关系(r=0.55, p 0.05). 图3tgfβ3 mrna和endoglin/cd105 mrna在食管癌中的相关性 3讨论 实验证明tgfβ1过度表达可增加肿瘤血管密度和转移潜能［9］，可增加vegf，降低thrombinspondin1，从而促进血管生成；tgfβ1中和抗体、反义治疗或阻断tgfβ的信号传导通路可抑制血管生成，延缓肿瘤生长［2,10-11］. tgfβ通过与细胞跨膜蛋白受体结合发挥其生物作用，其跨膜蛋白受体有三种亚型tgfβ rⅰ, rⅱ, rⅲ. rⅰ和rⅱ结构相似，具有丝氨酸苏氨酸激酶活性;rⅲ则不具有激酶活性，也不是信号传导所必须，但其可促进tgfβ1, tgfβ2和tgfβ3与rⅰ, rⅱ结合. endoglin（又称cd105）是mr约为180 000的跨膜糖蛋白，主要在增殖活跃的内皮细胞中表达. 近年对cd105在组织中的分布及其功能的研究越来越显示出其在血管生成中的作用. 目前认为它是新生血管生成的显著标志. 内皮细胞表达的cd105持续保持磷酸化，提示其在信号传导过程中和/或与胞质内蛋白质相互作用过程中具有一定作用. 有资料显示 cd105是tgfβ受体系统的成分之一，它能与tgfβ rⅰ和rⅱ共免疫沉降，它通过与tgfβ rⅰ和/或rⅱ相互作用促进tgfβ1和 tgfβ3与其受体高亲和力结合，且 tgfβ1可上调cd105基因表达，cd105过度表达调节多种细胞对tgfβ的反应， lastres等［12］证实在u937白血病细胞中导入cd105可抑制tgfβ1诱导的细胞黏附、纤维连接蛋白（fibronectin）的合成、血小板内皮细胞黏附分子1的磷酸化. letamendia等［13］也在大鼠成肌细胞中证实cd105过度表达可抑制tgfβ1诱导的生长抑制和纤维蛋白溶解酶激活抑制因子（plasminogen activator inhibitor1, pai1）的合成. li等［14］用反义技术证实抑制体外培养内皮细胞的cd105表达增强了tgfβ1抑制其生长和迁移. 这些研究结果提示cd105可影响细胞对tgfβ1的特异反应，调节tgfβ受体复合物释放的细胞内信号，因此血管生成过程依赖于tgfβ和cd105的相互作用. 本研究发现食管癌组织tgfβ1, tgfβ3, endoglin /cd105mrna水平较癌旁组织显著升高，tgfβ2无明显变化. tgfβ与cd105存在显著相关性或相关趋势，提示tgfβ1, tgfβ3和endoglin（cd105）参与了食管鳞状细胞癌血管生成过程的调节. endoglin（cd105）不仅是增殖内皮细胞的标记物，而且是细胞膜上tgfβ受体中调节tgfβ生物学功能的一个重要分子，因此调节endoglin（cd105）的功能可能成为抗血管治疗中的一个潜在的、具有较宽生物防治谱的靶点. 【参考文献】 ［1］ massagu j. the transforming growth factorβfamily ［j］. annu rev cell biol, 1990,6: 597-641. ［2］ cua dj, kastelein ra. tgfbeta, adouble agent in the immune pathology war ［j］. nat immunol, 2006; 7(6): 557-559. ［3］ rama s, suresh y, rao aj. tgf beta1 induces multiple independent signals to regulate human trophoblastic differentiation: mechanistic insights ［j］. mol cell endocrinol, 2003,206(12):123-136. ［4］ ye l, zhang hy, wang h, et al. effects of transforming growth factor beta 1 on the growth of rhabdomyosarcoma cell line rd ［j］. chin med j (engl), 2005,118(8):678-686. ［5］ platten m, wick w, weller m. malignant glioma biology: role for tgfbeta in growth, motility, angiogenesis, and immune escape ［j］. microsc res tech, 2001,52(4):401-410. ［6］ 郭敏，王立东，ding i. 食管鳞状上皮细胞癌中il8 mrna 水平的检测及其与cd105血管距离的关系［j］. 胃肠病学和肝病学杂志，2002,11（3）:662-264. ［7］ fenton bm, paoni sf, lee j, et al. quantification of tumor vasculature and hypoxia by immunohistochemical staining and hbo2 saturation measurement ［j］. br j cancer, 1999,79(34):464-471. ［8］ 郭敏，高珊珊，宋子博，等. 食管癌高发区食管癌组织中vegf, angiopoietin及其受体的表达及意义［j］. 胃肠病学和肝病学杂志, 2004,13（3）:253-257. ［9］ hasegawa y, takanashi s, kanehira y, et al. transforming growth factorbeta1 level correlates with angiogenesis, tumor progression, and prognosis in patients with nonsmall cell lung carcinoma ［j］. cancer, 2001,91(5):964-971. ［10］ morena am, oshima ct, gebrim lh, et al. early nuclear alterations and immunohistochemical expression of ki67, erbb2, vascular endothelial growth factor (vegf), transforming growth factor (tgfbeta1) and integrinelinked kinase (ilk) two days after tamoxifen in breast carcinoma ［j］. neoplasma, 2004,51(6):481-486. ［11］ benckert c, jonas s, cramer t, et al. transforming growth factor beta 1 stimulates vascular endothelial growth factor gene transcription in human cholangiocellular carcinoma cells ［j］. cancer res, 2003,63(5):1083-1092. ［12］ lastres p, letamendíaa, zhang h, et al. endoglin modulates cellular response to tgfβ1 ［j］. j cell biol, 1996,133(5):1109-1121. ［13］ letamendía a, lastres p, botella lm, et al. role of endoglin in cellular responses to transforming growth factorβ［j］. j biol chem, 1998,273:33011-33019. ［14］ li c, hampson in, hampson l, et al. cd105 antagonizes the inhibitory signaling of transforming growth factor β1 on human vascular endothelial cells ［j］. faseb j, 2000,14(1):55-64.