内容
作者：田鹏玮，刘同祥，杨芳，孙颖，张宗申
【摘要】 目的研究草酸在光照和不同温度条件下对人参愈伤组织细胞生长及次生代谢物质积累的影响。方法利用人参悬浮细胞培养体系,通过改变培养条件和在培养基中添加草酸,通过一定时间的培养后检测细胞增长和次生代谢成分的积累。结果光照和培养温度对草酸的诱导效果有很大影响，其中在12 h/d的光照下， 0.01～1 mmol·l-1的草酸对细胞生长和皂苷积累都有促进作用，而10 mmol·l-1的草酸对多糖积累有促进作用;在4个温度(22，24，26和28℃)水平下，随着培养温度的升高，添加草酸对细胞生长的抑制作用增强，但有利于多糖和皂苷的积累。结论在使用草酸作为诱导子时，选择合适的培养温度和光照条件有利于培养细胞的生长和次生代谢物质积累。
【关键词】 人参; 草酸; 愈伤组织; 多糖; 皂苷
abstract：objectiveto study the effects of oxalate treatment on both the growth and secondary metabolite accumulation of ginseng callus cells. methodsexamine the cell growth and accumulation of secondary metabolites of suspension ginseng cells after modulation of culture conditions and addition of oxalate into the medium.resultsboth culture temperature and lumination braught about manifest effect on the induction of cell growth and secondary metabolite accumulation by oxalate. in a 12 h cycle of light/darkness, the oxalate at the concentration range of 0.01 to 1 mmol·l-1 improved the cell growth and saponin accumulation, however, 10 mmol·l-1 oxalate could exhibit effective induction on polysaccharide accumulation. in the four levels of culture temperature (22,24,26 and 28℃), addition of oxalate could increase its inhibition on the cell growth with the elevation of culture temperature, however, which could increase the accumulation of both polysaccharides and saponin. conclusionadoption of proper lumination period and culture temperature will favor the accumulation of secondary metabolies accumulation and cell growth when oxalate is applied to the cell culture as an elicitor.
key words：ginseng; callus; oxalate; polysaccharide; saponin
在培养基中添加诱导子是提高植物细胞次生代谢能力的有效手段，它们的诱导效果都得到了大量试验结果的验证[1]。www.11665.cOM在红豆杉细胞培养时加入水杨酸,可以使紫杉醇最高含量达到6.8 mg/ l ,比对照提高约6倍[2]。ketchum等[3]发现加入茉莉酮酸甲酯, 也能促进紫杉醇合成。国内外均有报告认为草酸是一种非常有效的非生物诱抗剂，张宗申等[4]和李玉红等[5]发现草酸可以诱导黄瓜对炭疽病和霜霉病产生局部和系统的持久抗性。上述结果说明，使用诱导子可以改善培养细胞在逆境下的生长和次生代谢状况。
本研究以人参愈伤组织为材料，研究在不同温度和光照条件下添加草酸对细胞生长和次生代谢的影响，找出草酸作为诱导子的合适使用方法。
1 材料
本研究所用的新鲜4年生人参radixginseng ginseng.根均来源于吉林人参养殖场，取侧根的根尖部分作外植体诱导人参愈伤组织。
2 方法
2.1 诱导子的添加 草酸溶液在使用前均用微孔滤膜(0.45 μm)进行过滤灭菌。取一定量的草酸溶液加入到培养基中使其终浓度为0.01，0.1，1，10 mmol·l-1，分别在22，24，26，28℃和24，26℃下光照12 h/d培养到28 d收获细胞，然后测定其干重、人参多糖和人参皂苷的含量。
2.2 细胞干重的测定收集愈伤组织在60℃恒温箱中干燥至恒重,精确称重、保存。
2.3 人参多糖的测定
2.3.1 提取[6]将愈伤组织在50℃下烘干至恒重，粉碎，准确称取1.500 g，用滤纸包好置索氏提取器中加入适量70% 的乙醇提取3 h。滤纸包挥干乙醇，放于小烧杯中加入20倍量的去离子水超声波提取110 min。水提液浓缩定容于25 ml的容量瓶中备用。
2.3.2 含量测定 采用蒽酮比色法[7]的方法测定人参多糖。
2.4 人参皂苷总量的测定人参中人参总皂苷含量的测定采用国家标准的方法-gb/t15517.1-1995。对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷re标准品10 mg，加甲醇5 ml，振荡，摇匀，待用。
精密称取对照品溶液与样品溶液各50 μl，分别置具塞刻度试管中，蒸干后，加入8%香草醛乙醇试剂液0.5 ml(8%香草醛乙醇试剂液：取香草醛0.8 g，加无水乙醇使溶解成10ml，摇匀，即得)，体积分数72%硫酸试剂液5 ml，充分摇匀，混匀后置60℃恒温水浴锅上加热10 min，立即用冷水冷却10 min，摇匀，以试剂作空白，于544 nm波长下分别测定吸收度[8]。 3 结果
3.1 草酸在不同温度下对细胞生长及代谢物生成的影响见图1。
由图1-a对照组可知随着温度的上升细胞生长受到了抑制，0.1和1 mmol·l-1组在各个温度下均高于对照组，1 mmol·l-1组在26℃时显著促进了细胞生长，而10 mmol·l-1草酸抑制细胞的生长。从图1-b对照组可以看出温度对多糖含量影响不大，在各个温度下均有高于对照组，其中在28℃草酸浓度0.01 mmol·l-1时取得最高值24.33 mg·g-1。从图1-c对照组可以看出温度升高皂苷含量略有升高，在22℃时0.1，1 mmol·l-1组高于对照组，24℃时0.01 mmol·l-1高于对照组，26℃时0.01，0.1高于对照组，28℃时0.01，1 mmol·l-1高于对照组，其中28℃1 mmol·l-1组取得最高值16.09 mg·g-1。
3.2 光照条件下草酸对细胞生长及代谢物生成的影响见图2。由图2-a可知草酸在0.01～1 mmol·l-1范围内，24℃，26℃光照条件下对细胞生长有很大的促进作用，0.01 mmol·l-1组和0.1 mmol·l-1组分别在两个温度中达到最高，10 mmol·l-1草酸抑制细胞的生长。由图2-b可知，除10 mmol·l-1草酸处理的细胞中多糖含量高于对照组，其它浓度下细胞中多糖含量无明显变化。由图2-c可知，草酸浓度在0.01～1 mmol·l-1范围内，人参细胞中的皂苷含量均高于对照组。草酸浓度为1 mmol·l-1时，在两个温度下含量都达到最高值20.19 mg·g-1和13.81 mg·g-1。培养基中加入一定浓度的草酸对细胞中皂苷的积累有促进作用，草酸浓度的控制起关键作用。
4 讨论
草酸在植物细胞内主要以草酸钙结晶的形式存在，草酸钙沉淀与细胞质中的游离态ca2+之间处于动态平衡之中，可以调节细胞内外ca2+的分布[9]。张宗申等[10]发现外源草酸处理可以减轻热胁迫下辣椒叶片的伤害，与草酸影响了细胞内外ca2+分布、结合态钙比例升高有很大关系。volk等[11]在研究pistia stratiotes 细胞代谢时发现，钙离子通道参与了细胞中草酸钙形成过程，直接调节细胞内外ca2+浓度。sanders[12]等提出，细胞质中ca2+的不同进出路线均能影响胞内ca2+的动态变化。结合本研究结果，草酸能保护高温、光照逆境下的人参细胞并且促进人参多糖和皂苷含量增加，可能与它调节细胞内外ca2+分布或引起ca2+信号有关。
【参考文献】 [1] 肖春桥, 高 洪,池汝安. 诱导子促进植物次生代谢产物生产的研究进展[j]. 天然产物研究与开发，2004，16(5):473. [2] 苗志奇，未作君，元英进.水杨酸在紫杉醇生物合成中诱导作用的研究[j].生物工程学报，2000，16(4):509. [3] ketchum r e b，gibson d m，croteau r b，et al. the kinetics of taxoid accumulation in cell suspension cultures of taxus following elicitation with methyl jasmonate[j].biotechnology and bioengineering，1999，62(1):97. [4] 张宗申，彭新湘，李明启. 非生物诱抗剂草酸对黄瓜叶片中过氧化物酶的系统诱导作用[j]. 植物病理学报, 1998， 28:145. [5] 李玉红 , 陈 鹏，程智慧，等.草酸和bth对黄瓜幼苗霜霉病抗性和胞间隙病程相关蛋白的诱导[j]. 植物病理学报，2006，36 (3): 238. [6] 张桂娟,江蔚新,陈明小.黄芪叶中有效成分含量的研究[j].黑龙江医药，2004，17(3)：164. [7] 陈毓荃.生物化学实验方法和技术[m].北京：科学出版社，2002：171. [8] 高丽萍, 刘 华, 封云芳.人参总皂苷的含量测定[j].浙江工程学院学报，2002，19(3)：171. [9] 彭新湘，李明启.植物中的草酸及其代谢[j].植物生理学通讯，1992，28(2)：93. [10] 张宗申，利容千，王建波.草酸处理对热胁迫下辣椒叶片膜透性和钙分布的影响[j].植物生理学报，2001，27(2):109. [11] volk gm, goss lj，franceschi vr. calcium channels are involved in calcium oxalate crystal formation in specialized cells of pistia stratiotes l[j]. annals of botany，2004，93: 741. [12] sanders d, brownlee c, harper jf. communicating withcalcium[j]. plant cell, 1999, 11: 691.