内容
【摘要】 目的利用hplc指纹图谱技术，全面揭示柴胡煎煮前后皂苷类成分的变化。方法采用hypersil c18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈 - 水, 梯度洗脱 [0 ～ 70 min: 乙腈 - 水 (22∶78) → (50∶50) ]; 流速1.0 ml·min-1;柱温30 ℃;检测波长210，252 nm。 结果柴胡煎煮后的指纹图谱中出现了9个药材中不存在的新色谱峰。 结论对柴胡煎煮中新出现的皂苷类成分进行深入系统的研究，将有助于从中医角度揭示中药柴胡功效的物质基础。
【关键词】 柴胡; 煎剂; 柴胡皂苷; 高效液相色谱; 指纹图谱
abstract：objectiveto disclose the changes of saikosaponins between radix bupleuri and its water extract by hplc fingerprint technology. methodsthe hplc fingerprint was performed on a hypersil c18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with gradient elution of acetonitrile - water [0 - 70 min：acetonitrile - water (22∶78) → (50∶50)], the flow rate was 1.0 ml·min-1, the column temperature was set at 30 ℃, and the detection wavelength was 210 and 252 nm. resultsnine peaks which did not exist in radix bupleuri were found in its water extract. conclusionfurther research should be carried on the nine new components appeared in the water extract of radix bupleuri to explain the functions of saiko.
key words： radix bupleuri; water extraction; saikosaponin; hplc; fingerprint
已有报道指出，柴胡在煎煮过程中皂苷类成分存在结构的转变[1]，但是人们在柴胡的提取工艺研究当中，往往采取各种措施来避免这种转变的发生，如碱性溶剂提取[2]、低温浓缩[3]、渗漉等[3]，上述措施虽然提高了柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的转移率，却导致了人们对柴胡煎剂中的皂苷成分，即转化的成分，缺乏深入系统的认识。wwW.11665.coM煎剂作为传统中药临床用药的主要形式，是中医药理论建立的基础，对于煎剂中成分认识的程度决定了人们对中医中药认知的程度。基于此，我们采用hplc指纹图谱技术首次对柴胡煎剂中皂苷类成分的全貌进行了研究，并与药材中的成分进行比较，为进一步揭示中药柴胡的功效奠定基础。
1 仪器与试药
waters 600高效液相色谱仪，紫外检测器，empower色谱工作站，kq-50db超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司)，mettler-ae 240型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)。柴胡药材(洛阳嵩县、山西太原、辽宁沈阳、河北承德)购于洛阳关林药材市场，经河南科技大学化工与制药学院王忠东教授鉴定为伞形科植物北柴胡bupleurum chinense dc.的干燥根。乙腈(迪马公司，色谱纯)，屈臣氏蒸馏水，ab-8型大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂)，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
2.1.1 柴胡煎剂中皂苷类成分[4]取适当粉碎的柴胡药材20 g，10倍量水煎煮2次，1 h/次，趁热过滤，合并滤液，水浴浓缩，最后定容至50 ml量瓶中。取2.5 ml上述浓缩液(折合生药材1.0 g)，上样于装有10 ml大孔吸附树脂的层析柱，进行动态吸附，待吸附完毕后，先用体积分数为5% 的naoh 水溶液50 ml洗脱，弃去;然后用水洗脱至流出液为中性;再用体积分数为30% 的乙醇溶液50 ml洗脱，弃去;最后用体积分数为95%的乙醇溶液160 ml洗脱，收集体积分数为95%的乙醇溶液洗脱部分，于水浴上浓缩至干，用体积分数为50%的乙醇定量转入10 ml量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.1.2 药材中皂苷类成分[5]取柴胡药材粗粉1.0 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，加入体积分数为5%的氨性甲醇溶液50 ml，浸润30 min，超声1 h，用甲醇补足至原重，静置，吸取上清液25 ml，置于蒸发皿中，于水浴上浓缩至干，用甲醇定量转移至5 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2 色谱条件[6]大连伊利特hypersil c18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈- 水, 梯度洗脱 [0～70 min, 乙腈- 水(22:78) →(50:50)]; 流速1.0 ml·min-1;柱温30 ℃;检测波长210，252 nm;进样量20 μl。按照此色谱条件得各供试品溶液色谱图。见图1。
2.3 稳定性实验取洛阳嵩县柴胡药材适量，按照“2.1”项下方法制备各供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h进样，记录指纹图谱。结果表明，柴胡药材及其煎剂的各主要色谱峰的保留时间和峰面积无明显变化，rsd分别为0.58%～1.13%，0.32%～1.21%(210 nm)和0.65%～1.50%，0.23%～1.45%(252 nm)。说明供试品溶液在12 h之内稳定。
2.4 精密度实验取洛阳嵩县柴胡药材适量，按照“2.1”项下方法制备各供试品溶液，重复进样6次，记录指纹图谱。结果表明，柴胡药材及其煎剂的各主要色谱峰保留时间和峰面积无明显变化，rsd分别为0.33%～1.39%，0.56%～1.55%(210 nm)和0.70%～1.93%，0.51%～1.43%(252 nm)。说明仪器精密度良好。
2.5 重复性实验取洛阳嵩县柴胡药材适量，精密称定，按照“2.1”项下方法制备各供试品溶液6份，记录色谱图。结果表明，柴胡药材及其煎剂的各主要色谱峰保留时间和峰面积的rsd为0.62%～1.01%，1.13%～2.38%(210 nm)和0.63%～1.36%，0.86%～1.83%(252 nm)。说明重复性良好。 a 柴胡煎剂 (210 nm);b 柴胡药材 (210 nm);
c 柴胡煎剂 (252 nm);d柴胡药材 (252 nm)
图1 柴胡煎剂及药材的指纹图谱
2.6 样品测定取不同产地的柴胡药材(洛阳嵩县、山西太原、辽宁沈阳、河北承德)，分别混合均匀，按照“2.1”项下方法制备各供试品溶液，并记录指纹图谱。对不同产地的柴胡药材比较其煎煮前、后的皂苷类成分的指纹图谱，发现煎煮后出现了大量药材中不含有的色谱峰。结果见表1。表1 柴胡煎煮后指纹图谱中色谱峰的变化“*”表示该峰煎煮后消失;“**”表示 该峰为煎煮后新生成的色谱峰3 讨论
结合文献[5]及表1可知，柴胡煎煮后柴胡皂苷a(44.08 min)的含量大为减低，柴胡皂苷d(59.04 min)完全消失。同时，在252 nm 波长下出现9个新的色谱峰(13.98，18.19，26.08，30.92，37.55，44.21，46.21，49.98，57.71 min)。
煎煮后新出现的9个色谱峰其紫外图谱相同，见图2。提示新生成的柴胡皂苷的结构母核中均含有11,13(18) 共轭环外双键结构。
图2 新生成色谱峰的紫外图谱
在测定时通过多波长下的hplc指纹图谱比较，发现252 nm波长下的图谱可较好地反映柴胡煎煮后新生成的成分，因此检测波长除了选择柴胡皂苷常用的210 nm，同时还选择了252 nm。
对于柴胡的药理研究，绝大多数的文献均是关于柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d[7，8]，而关于其它类型柴胡皂苷的药理研究较少。本实验的结果表明，柴胡汤剂中含有大量的其它类型的柴胡皂苷，对于该类成分的研究有利于更好地揭示中药柴胡的功效。
【参考文献】 [1] 刘密新，吴祝平，杨成对，等.中药复方中柴胡皂苷a和d的lc/ms/ms研究[j].质谱学报，2000，21(3)：77. [2] 邬科芳，倪力军，张立国.不同提取工艺对柴胡中柴胡皂苷a含量的影响[j].中成药，2006，28(8)：1230. [3] 黄成钢，马春晖，朱海燕，等.一种皂苷类成分的医学用途[p].中国专利：cn 101062046a，2007-10-31 . [4] 王胜春，李晓玮，王俊琴.反相高效液相色谱法测定柴胡及柴葛颗粒中柴胡皂苷d的含量[j].时珍国医国药，2004，15(5)：262. [5] 林东昊，茅仁刚，王智华，等.23种国产柴胡属植物中柴胡皂苷a，c，d含量的rp - hplc测定[j].药物分析杂志，2004，24(5)：479. [6] 李 军，姜 华，石任兵，等.四逆散不同配伍对柴胡皂苷b1、h提取量的影响[j].中国中药杂志，2008，33(15)：55. [7] 王艳丽，和水祥，罗金燕.柴胡皂苷抗肿瘤机制研究进展[j].中西医结合学报，2006，4(1)：98. [8] 朱兰香，刘世增，顾振纶.柴胡皂苷的药理作用及抗肝纤维化的应用[j].中草药，2002，33(10)：附5.