内容
作者：黄凌，黎继烈，杨杰，崔培梧，文蓉
【摘要】 目的探讨缬草醚酯提取物体外抗氧化活性。方法采用dpph法、邻苯三酚自氧化法、水杨酸法，分别测定缬草醚酯提取物清除dpph自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的能力。结果样品中活性物质对于dpph自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基等自由基半清除率浓度(ic50)分别为1.36，1.46和2.14 mg/ml。结论在实验条件下，缬草醚酯提取物对dpph自由基、羟自由基、超氧阴离子有较好的抑制作用。
【关键词】 宽叶缬草; 自由基; 抗氧化活性
abstract：objectiveto study the antioxidant activity in vitro of ether and grease extract from valeriana offeinalis l.methods the methods of dpph , pyrograllol auto-oxidation and salicylicl acid were used in order to get the scavenging quality of dpph free radical(dpph·) , superoxide free radical (o2-·) and hydroxyl free radical (oh·) in the methanol extract of valeriana offeinalis l . resultsthe half maximal inhibitory concentration(ic50) of sample on dpph· , o2-· and oh· were 1.36 ，1.46 and 2.14 mg/ml . conclusionthe extract has good scavenging effect on dpph·, oh· and o2-· under the condition of experiment.
key words： valeriana offeinalis l. ; free radicals; antioxidation
缬草属valeriana l.约有250种，分布于欧亚大陆、南美和北美中部。Www.11665.CoM缬草可作香料、药用及观赏，缬草的药理作用主要是镇静安神、解痉镇痛[1]、改善微循环[2]、抗抑郁和抗肿瘤作用[3]等。多数缬草属植物的根茎及发达的须根含有环烯醚酯等化学成分，有良好的药用价值，在民间有作药用的历史[4]。
本实验采用dpph法、邻苯三酚氧化法、水杨酸法检测缬草醚酯提取物对dpph自由基(dpph·)、超氧阴离子自由基(o2-·)、羟基自由基(oh·)的清除能力。
1 材料与仪器
1.1 样品制备宽叶缬草valeriana offeinalis l.采于湖南湘西自治州，取其根，除杂备用。称取缬草根材料100 g，加入2 g caco3,300 ml蒸馏水于高速捣碎机中粉碎后移入1 000 ml三角瓶中超声处理20 min。 加入300 ml乙醚、醋酸乙酯混合液(1∶1)于三角瓶中，于25 ℃下振荡萃取2 h(密封)。抽出上层混合液，真空浓缩至膏状取出，冷冻干燥。所得膏状物用无水乙醇复溶于50 ml容量瓶制成20.0 mg/ml样品溶液，于4 ℃温度下保存备用。
1.2 仪器uv-1700型紫外分光光度仪(日本 岛津上海有限公司);r201d-ⅱ型旋转蒸发仪(郑州 长城科工贸有限公司);jj-2b型电动高速捣碎机(江苏 荣华仪器制造有限公司);as 2060b型超声清洗器;fd-1a型冷冻干燥机(北京 博医实验仪器公司)。
1.3 试剂1，1-二苯基苦基苯肼(dpph)(sigma 公司);抗坏血酸、茶多酚、三羟甲基氨基甲烷(tris)、邻苯三酚、水杨酸、硫酸亚铁、无水乙醇、乙醚、醋酸乙酯、浓盐酸、双氧水(30%)等均为国产分析纯。
2 方法
2.1 缬草醚酯提取物清除dpph·自由基能力测定dpph自由基清除实验参照彭长连等[5]方法，并依据缬草提取物成分特性对具体操作做出改动。dpph溶液的配制：准确称取19.70 mg dpph用无水乙醇溶解并定容于250 ml容量瓶中，dpph浓度为2.0 × 10-4 mo1/l，避光保存(0 ～ 4℃)。
取样品溶液2.0 ml稀释10倍后移入25 ml三角瓶中。分别移取200，400，600，800，1 000 μl稀释液于试管中，用无水乙醇补足到2.0 ml后编号。每支试管各加入2.0 × 10-4 mol/l dpph溶液2.0 ml均匀混合，在28 ℃下避光静置30 min。以无水乙醇调零，于λ516测定其吸光度a。空白对照组采用无水乙醇替代dpph溶液，其他试剂与样品组相同。各组实验组均做3次平行，取均值。dpph·自由基清除率按下式计算。
清除率(%)=a0-(a1-a1')a0×100%
式中：a0 ——2.0 ml乙醇加2.0 ml dpph溶液的吸光度;
a1 ——2.0 ml样品溶液加2.0 ml dpph溶液的吸光度;
a1'——2.0 ml样品溶液加2.0 ml乙醇的吸光度。
2.2 缬草醚酯提取物清除羟基自由基(oh·)能力的测定利用fenton反应法产生oh·，oh·与水杨酸反应产生有色物质，该产物在λ510有强吸收峰。若体系中加入清除oh·的物质，则会减少有色物质生成，吸光度降低[6,7]。具体操作为：取样品溶液2.0 ml稀释10倍后移入25 ml三角瓶中。分别移取400,600,800,1 000 ,1 200 μl稀释液于试管中，用无水乙醇补足到2.0 ml后编号。每支试管各加入1.0 × 10-2 mol/l feso4 l.0 ml，1.0 × 10-2 mol/l水杨酸-乙醇溶液2.0 ml，最后加入30% h2o2 2.0 ml启动反应，于室温下反应1 h。以蒸馏水调零，测λ510样品的吸光度。考虑到试剂与提取物溶液的协同增色效应，以蒸馏水2.0 ml替代30% h2o2 2.0 ml，其他试剂与样品组相同。各组实验组均做3次平行，取均值。羟基自由基的清除率按下式计算。
清除率(%)= a0-(a1-a1')a0×100%
式中：a0 ——以无水乙醇代替样品液的吸光度;
a1 ——样品组的吸光度;
a1′——蒸馏水代替h2o2的空白对照组吸光度。 2.3 缬草醚酯提取物清除超氧阴离子自由基(o2-·)能力的测定采用邻苯三酚氧化法[8]，依据缬草提取物成份特性采用抗坏血酸替代浓盐酸阻断邻苯三酚自氧化反应，并对具体操作作出改动。tris-hcl缓冲液(ph 8.2)配制：准确称取tris碱 30.290 g溶于200 ml双蒸水中，加入9.5 ml浓盐酸后，用双蒸水定容于250 ml容量瓶中。邻苯三酚溶液配制：准确称取邻苯三酚0.220 7 g溶于25 ml 1.0 × 10-2 mol/l抗坏血酸溶液中，用双蒸水定容于250 ml容量瓶中。取样品溶液2.0 ml稀释10倍后移入25 ml三角瓶中，分别移取200,400 ,600,800 ,1 000 μl于试管中，用无水乙醇补足到2.0 ml后编号，每支试管加入3.0 ml tris-hcl缓冲液(ph 8.2)，于25 ℃水浴平衡20 min后，加入1.0 ml 7.0 × 10-4 mol/l邻苯三酚溶液，以试剂空白组开始变色为反应开始时间，反应4 min，加入4.0 ml 1.0 × 10-2 mol/l抗坏血酸溶液阻断邻苯三酚自氧化(阻断时间约为10 min)。以蒸馏水调零，测λ420样品的吸光度a。考虑到试剂与提取物溶液的协同增色效应，空白对照组同样加入1.0 ml 7.0 × 10-4 mol/l的邻苯三酚溶液，与样品组不同的是在加入邻苯三酚后立刻加入4.0 ml 1.0 × 10-2 mol/l抗坏血酸溶液阻断反应，静置4 min后测定λ420吸光度a。各组实验组均做3次平行，取均值。超氧阴离子自由基清除率按下式计算。
清除率(%)= a0-(a1-a1')a0× 100%
式中：a0 ——以无水乙醇代替样品液的吸光度;
a1 ——样品组的吸光度;
a1′——提前阻断邻苯三酚自氧化反应空白对照组吸光度。
3 结果
3.1 缬草醚酯提取物对dpph·自由基的清除作用dpph法是目前使用广泛的检测自由基清除能力的方法之一。dpph是一种紫黑色的稳定的有机自由基，它可以通过与供氢体作用从而失去其发色团变成黄色，通过测定λ516吸光值a的变化反映样品的自由基清除能力，进而推测其抗氧化活性。
如图1所示，当样品浓度的浓度为0.4 μg/ml时，对dpph自由基的清除率为19.2%;当浓度增至2.0 μg/ml时，清除率提高到67.7%，增幅为48.5%。由实验结果可知，缬草醚脂提取物对dpph自由基的清除效果与样品浓度之间有很好的线形关系。
根据试样浓度与自由基清除率的关系求出线性回归方程，并得出清除50%自由基时所需试样浓度(ic50)。半数清除率ic50大小与其自由基清除能力成反比，即ic50越小，表明该种试样物质清除能力越强。线性回归方程为：清除率(%)=30.375c + 8.650,r2=0.993 8，依据方程计算出缬草醚酯提取物ic50=1.36 μg/ml，结果见图2。由图2所示，抗坏血酸和茶多酚ic50值分别为0.14 μg/ml和1.97 μg/ml。样品对dpph自由基清除能力低于抗坏血酸而高于茶多酚。
3.2 缬草醚酯提取物对超氧阴离子自由基的清除作用超氧阴离子自由基是活性氧的一种，是机体内寿命很长的自由基，通常作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的oh·自由基，能对机体造成很大的危害，而且生物体自身氧化还原反应能产生该自由基。对超氧阴离子自由基的清除也是活性物质抗氧化的重要指标。
如图3所示，当样品浓度的浓度为0.4 μg/ml时，对超氧阴离子自由基的清除率为16.7%;当浓度增至2.0 μg/ml时，清除率提高到63.1%，增幅为46.4%。由此可见，缬草醚酯提取物对超氧阴离子自由基有较强的清除能力，清除效果与其浓度之间存在量效关系。
缬草醚酯提取物对超氧阴离子自由基清除能力的比较采用抗坏血酸、茶多酚作为对照。根据试样浓度与自由基清除率的关系求出线性回归方程为：清除率(%)=31.814c + 3.652，r2=0.980 5，依据方程计算出缬草醚酯提取物ic50=1.46 μg/ml，结果见图4。由图4所示，抗坏血酸和茶多酚ic50值分别为1.07 μg/ml和2.08 μg/ml。样品对超氧阴离子自由基清除能力要比茶多酚强，稍弱于抗坏血酸。
3.3 缬草醚酯提取物对羟自由基的清除作用羟自由基可以与生物体内的多种分子作用，是对生物体毒性很强的一种自由基。对羟自由基清除率是反映活性物质抗氧化能力的重要指标。
如图5所示，缬草醚酯提取物对羟自由基的清除能力较强，清除能力与样品浓度在一定质量浓度范围内有正相关性。在0.8 μg/ml浓度时，对羟自由基清除效果为20.9%;当浓度增至2.4 μg/ml时，清除率提高到55.3%，增幅为33.4%。根据试样浓度与羟自由基清除率的关系求出线性回归方程为：清除率(%)=22.157c+ 2.480，r2=0.989 7，依据方程计算出缬草醚酯提取物ic50=2.14 μg/ml，结果如图6。以抗坏血酸和茶多酚清除羟自由基效果作为样品清除羟自由基能力比较，对照品ic50值分别为0.24 μg/ml和3.41 μg/ml。对羟自由基清除能力为抗坏血酸最好，样品次之，茶多酚最差。
4 小结
缬草醚酯提取物中活性物质对于dpph自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基等自由基都表现出较好的清除作用，清除效果依次为dpph· o2-· oh·。半清除率浓度(ic50)分别为1.36，1.46和2.14 μg/ml，样品抗氧化能力要优于对照品茶多酚抗氧化能力，比对照品抗坏血酸抗氧化能力略低。
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