高效液相色谱法测定安眠补脑口服液中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量
内容
【摘要】 目的建立高效液相色谱法测定安眠补脑口服液中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷的含量。方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水(15∶85)作为流动相，检测波长为320 nm，外标法定量。结果2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷线性范围0.248 4～4.968μg(r=0.999 9)，平均回收率为98.73%。结论方法简便、快速、准确，适合于该产品质量检验分析。
【关键词】 安眠补脑口服液; 高效液相色谱法; 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷
安眠补脑口服液原标准中测定制何首乌中水解产物大黄素的含量，由于大黄素的含量因水解条件的不同而造成波动，影响测定结果的稳定性和规律性。本文采用高效液相色谱法，测定处方中主药制何首乌所含有效成分2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷的含量，参照《中国药典》2000年版一部制何首乌中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷的含量测定方法，建立了一种灵敏度高，专属性强的高效液相色谱法测定制剂中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷的含量方法。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：agilent 1100 series vwd紫外检测器、依利特hyperisil c18色谱柱(4.6 mm×250 mm，10 μm，大连依利特)，lc-350a型超声波中药处理机(济宁市中区鲁超仪器厂);2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷对照品(含量测定用，批号购自中国药品生物制品检定所)，试剂均为分析纯和色谱纯，水为重蒸馏水。wwW.11665.COm
2 方法与结果
2.1 耐用性实验
2.1.1 色谱条件影响因素的确定
检测波长的确定：测定波长对测定方法的检测影响较大，故方法经实验进行确定。参考文献[1]2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷检测波长为320 nm，取2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷适量，加稀乙醇溶解，以稀乙醇作空白，在波长200～400n m之间扫描，结果2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷在320 nm处有最大吸收峰，与文献报道一致，从而确定本法采用320 nm为检测波长。
色谱条件确定：色谱柱为大连依利特hyperisil c18(4.6 mm×250 mm，10 μm)，柱温30℃，流速1.0 ml/min，以上均采用常规条件。
流动相的确定：参照《中国药典》2000年ⅰ部和2005年版ⅰ部制何首乌的含量测定方法，选择乙腈-水(15∶85)作为流动相，对2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷对照品分离较好，此条件下2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷与其它组分均能达到基线分离。
不同品牌色谱柱测定结果：分别选用hypersil c18 (4.6mm×250mm，10μm，大连依利特制造)和azchromc18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)配制一定量2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷对照品溶液，分别进样10 μl，色谱峰对称性较好，测定理论塔板数，根据测定结果，理论板数按2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷峰计算，应不低于4 000。见表1。 表1 理论塔板数测定结果
2.1.2 供试品溶液的制备因该药味在处方中为水提物，成分在成型的液体制剂中应属溶解状态，故制备时将溶液制成含醇量为50%，适合2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷溶解的溶液中即可。取本品5 ml置10 ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，静置，即得。
2.1.3 稳定性和重复性实验为对供试液稳定性和方法系统适用性实验中重复性进行考察，取供试品溶液10 μl注入液相色谱仪中，重复进样5次，结果峰面积积分值的相对标准偏差rsd 2.0%，表明本方法稳定性和重复性良好。结果见下表2。表2 精密度实验结果
2.2 线性关系考察精密称取干燥至恒重的2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷6.21 mg，置25 ml量瓶中，加稀乙醇适量溶解，并稀释至刻度，摇匀(0.248 4 mg/ml)。分别精密吸取 1.0，3.0，5.0，12.0，20.0 μl，注入液相色谱仪中测定，得线性方程为y=911.69x-78.88(其中y为积分值，x为进样量)，相关系数r为0.999 9，表明2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷进样量在0.248 4～4.968 μg之间范围内与峰面积呈良好的线性关系。结果见表3。 表3 线性关系考察结果
2.3 精密度实验按照分析方法验证指导原则，对方法的精密度按重复性内容进行考察。取本品(批号20050306)6份，按标准草案正文所述方法，制成供试液，依法测定含量，结果相对标准偏差 2.0%，表明本方法重复性良好。结果见表4。 表4 重复性实验结果 2.4 专属性实验按一个处方量配制缺制何首乌药材的阴性样品，吸取上述溶液5 μl，注入高效液相色谱仪中测定，可得缺制何首乌阴性样品色谱图，与供试品及对照品溶液同法制成的供试品色谱图和对照品色谱图中相比较，供试品及对照品溶液中对照品峰保留时间相同，阴性样品无干扰。
2.5 最小检出限测定按正文所述色谱条件，将2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷对照品溶液稀释配制至浓度为2.020 μg/ml，分别进样2，5，10 μl，结果当进样量为2 μl时，2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷对照品的色谱峰面积约为基线噪音的3倍，故最小检出量为2.024 μg/ml×2×10-3 ml=4.048×10-3 μg，表明高效液相色谱仪测定2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷灵敏度较高。
2.6 准确度采用加样回收法，取已知含量样品(20050306，含量平均值为0.297 1 mg/ml)共6份，每份3 ml，分别置10 ml量瓶中，各加入2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷对照品溶液(0.248 4 mg/ml)5ml，按正文所述方法测定，以下式计算回收率，结果表明本方法具有良好的回收率。结果见表5。
计算公式：
回收率(%)=测出对照品量-制剂中原有对照品量添加对照品量 表5 回收率测定结果
2.7 样品含量测定及限度确定取样品10批，按草案正文含量测定方法，测定，计算含量。结果见表6。表6 10批样品含量测定结
根据上述实验结果，考虑到生产实际以及制何首乌药材质量差异，本标准暂定本品每支含制何首乌以2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷(c9h8o4)计不得少于0.12 mg。
2.8 范围的确定为了确定方法能达到的准确测定的区间，实验考察了拟定范围的极端的准确度和精密度。实验根椐测定样品结果和由此拟定的限度。
2.8.1 将范围下限设在限度约-50%左右处即取样为0.12 mg/ml×5 ml×50%=0.3 mg的相当量，在此量处进行准确度的考察。方法是取已知含量样品(20050306，含量平均值为0.297 1 mg/ml)共6份，每份1 ml，分别置10 ml量瓶中，各加入2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷对照品溶液(0.248 g/ml)1 ml，按正文所述方法测定，以下式计算回收率，结果表明本方法具有良好的回收率。结果见表7。
计算公式：
回收率(%)=测出对照品量-制剂中原有对照品量添加对照品量
表7 范围测定回收率结果
样品
号取样量
m/g制剂中原有
对照品量m/mg加入对照
品量m/mg测出对照
品量m/mg回收率
(%)平均回收
率(%)rsd
(%)110.290.24840.537 799.72210.290.248 40.536 999.40310.290.248 40.537 799.7299.370.4410.290.248 40.536 6 99.28510.290.248 40.535 398.75
n=5
2.8.2 将范围上限设在限度约200%左右处即取样为0.12 mg/ml×5ml×200%=1.2mg的相当量，在此量处进行准确度的考察。方法是取已知含量样品(20050306，含量平均值为0.2971mg/ml)共6份，每份5 ml，分别置具塞量瓶中，各加入2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷对照品溶液(0.2484mg/ml)5ml，按正文所述方法测定，以下式计算回收率，结果表明本方法具有良好的回收率。结果见表8。
计算公式：
回收率(%)=测出对照品量-制剂中原有对照品量添加对照品量 表8 回收率测定结果
3 讨论
2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-о-β-d葡萄糖苷易溶解于稀乙醇溶液中，且诸药味在处方中为水提物，在本制剂中溶解状态，因此制备时将溶液制成含醇量为50%的溶液即可提取完全。根据文中的色谱条件实验表明该方法专属性及重复性良好，可以较好地控制安眠补脑口服液中何首乌的含量。
【参考文献】 [1] 国家药典委员会.中国药典，ⅰ部[s].北京：化学工业出版社，2005：122.
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