内容
作者：江南，曾瑾，清源，罗霞，杨志荣
【摘要】 目的研究寨卡提取物诱导人结肠癌lovo细胞凋亡的作用，并对其可能的作用机制进行探讨。方法以寨卡提取物作用于人结肠癌lovo细胞，采用mtt法分析寨卡提取物对lovo肿瘤细胞的抑制生长作用；采用annexin v-fitc荧光染色实验，考察细胞在药物作用下的质膜变化，对提取物诱导lovo细胞凋亡进行检测；采用比色法测定寨卡提取物对人大肠癌lovo肿瘤细胞内还原型谷胱甘肽（gsh）的耗竭作用和对谷胱甘肽-s转移酶（gst）的诱导作用；同时利用dcfh-da探针，检测lovo肿瘤细胞给药后的活性氧水平；应用western蛋白印迹法检测caspase-3和caspase-9蛋白的表达。结果寨卡提取物具有明显的体外抗肿瘤活性，并呈剂量依赖关系，ic50为550μg·ml-1。该药物可通过改变细胞质膜，耗竭细胞内谷胱甘肽含量，增加谷胱甘肽s转移酶含量，上调肿瘤细胞内活性氧水平等途径，提高caspase-3和caspase-9蛋白的表达，诱导lovo细胞发生凋亡。结论寨卡提取物可诱导lovo细胞凋亡，其作用机制可能通过耗竭细胞内gsh 的含量，以ros为介导直接作用于细胞线粒体，诱导凋亡的产生。寨卡提取物对lovo细胞凋亡的诱导作用还可能与其增加caspase-3和caspase-9蛋白表达有关。wWw.11665.COm
【关键词】 寨卡 细胞凋亡 结肠癌 lovo细胞
abstract：objectiveto study the induction of the extract from thlaspi arvense linn.(zaf) on apoptosis in human colorectal carcinoma lovo cells and its mechanisms in vitro.methodsmtt assay was employed to evaluate the survival of lovo cells. the induction of apoptosis was detected by annexin v-fitc staining. the depletion of glutathione (gsh) and the induction of glutathione-s-transferase (gst) effects of zaf in lovo cells were dectected. the level of reactive oxygen species (ros) in lovo cells was analyzed with dcfh-da as probe. the protein expressions of caspase-3 and caspase-9 in lovo cells were assayed by western blot. resultszaf effectively inhibited lovo cell viability in vitro and induced lovo cells apoptosis in a dose-dependent manner, and ic50 was 550μg·ml-1. zaf could obviously deplet the level of gsh level, increase activity of gst, and accumulate ros in lovo cells. over-expression of caspase-3 and caspase-9 mediated by zaf in a concentration-dependent manner were observed. conclusionzaf can induce apoptosis of lovo cells, which is relative to the changes of the cells redox states and upregulating caspase-3 and caspase-9 expression.
key words：thlaspi arvense linn. apoptosis； human colorectal carcinoma； lovo cells 寨卡是一味常用藏药，为十字花科植物thlaspi arvense linn.的干燥成熟种子。在传统藏医药应用中，寨卡性辛、微温，具有散风明目，活络通痹，温补五脏，清肺热、肾热，健胃之功效，主要用于治疗目赤肿痛流泪，肺热，咳嗽，肾热，淋病，消化不良，呕吐等病症。目前针对寨卡化学成分缺乏系统细致的报道，仅通过初步的植物化学研究所知，寨卡含黑芥子苷（sinigrin），又含脂肪油34％，挥发油0.836％，蔗糖1.8％，卵磷脂1.6％等［1］。本课题组的前期研究工作发现，寨卡中含有活性强烈的抗肿瘤成分，其有效部位为十字花科植物中富含的硫代葡萄糖苷（glucosinolate）类物质［2］，该有效部位提取物zaf体外抗肿瘤作用与其抑制细胞增值和诱导细胞凋亡有关［3］，本研究对寨卡提取物诱导lovo 肿瘤细胞凋亡的作用靶点和影响途径进行研究，以探讨寨卡提取物诱导细胞凋亡的作用机制，为开辟寨卡新的药用途径奠定理论基础。
1 材料与仪器
1.1 药品与试剂
寨卡有效部位提取物（active fractions of pennycress，zaf），由四川省中医药研究院中药细胞与分子生物学实验室提供。rpmi-1640培养基（gibco公司）；小牛血清（hyclone公司）；annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒（购自碧云天生物技术研究所）；谷胱甘肽-s转移酶测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（gsh）测定试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司）；活性氧检测试剂盒（购自北京普利莱基因技术有限公司）；兔抗肌动蛋白（β-actin）、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3），兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-9）抗体、抗小鼠igg、及抗兔igg均为santa cruz产品；ecl检测底物i和ii（pierce公司）；台盼蓝，mtt，sds，胰蛋白酶，edta·4na均购自sigma公司；青霉素，庆大霉素及其它试剂均为国产分析纯；硝酸纤维素膜(博士德)。
1.2 仪器与设备
倒置显微镜（nikon，ts10）；二氧化碳细胞培养箱（heraeus，bb5060uv）；酶标仪（themo electron，multiskan）；垂直电泳槽(bio-rad mini-protean 3)；转印槽(bio-rad trans-blot)；凝胶成相系统（bio-rad，chemidoc xrs）；电泳电源(bio-rad powerpac basic)。
2 方法
2.1 细胞培养
人结肠癌细胞lovo（atc编号：ccl-229），购于南京凯基生物科技发展有限公司。在本实验室常规培养于含10％小牛血清的rpmi-1640培养液培养中（青霉素100 ku·l-1，链霉素100 mg·l-1），放置于37℃，5％co2的培养箱下，取对数生长期细胞进行实验。
2.2 细胞增殖抑制作用的检测
lovo细胞（5.0×104个细胞/孔）接种于96孔板，用不同浓度的zaf作用48 h后，采用mtt法［4］，酶标仪于570 nm波长处测定各孔吸光度（a570），每个浓度组设3个复孔，细胞抑制率（%）= （对照组a-实验组a）/（对照组a-空白组a）×100%。并计算ic50。实验重复3次。
2.3 annexin v-fitc/pi荧光双染色
取对数生长期 lovo 细胞，按5×105个/孔接种于24孔平底细胞培养板，预培养24 h。设置3个药物作用浓度，分别为300，550，1 000 μg·ml-1，每种浓度设3个平行孔，同时做阴性对照孔（加细胞和培养液，不加药物；即药物浓度为0 μg·ml-1）。加药后继续培养36 h。利用annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒对lovo细胞死亡时质膜变化进行荧光染色检测。
2.4 western蛋白印迹法分析
caspase-3、caspase-9蛋白的表达lovo细胞与不同浓度的zaf作用36 h（200，400，800，1 000μg·ml-1）后，离心收集，按照试剂盒说明书提取细胞总蛋白，用bradford法测定蛋白浓度，采用western蛋白印迹法检测caspase-3、caspase-9蛋白的表达［5］，以肌动蛋白（β-actin）作为内标。
2.5 lovo肿瘤细胞内谷胱甘肽含量的检测
取对数生长期 lovo 细胞按1×106个/瓶接种于50 ml平底细胞培养瓶，预培养24 h。设置3个药物作用浓度，分别为300，550，1 000 μg·ml-1，同时做细胞阴性对照瓶（细胞和培养液）和阳性药物对照瓶（顺铂，药物浓度为10 μg·ml-1）。加药后继续培养24 h。利用还原型谷胱甘肽（gsh）测定试剂盒对lovo肿瘤细胞内谷胱甘肽含量进行测定。
2.6 lovo肿瘤细胞谷胱甘肽-s转移酶的测定
取对数生长期lovo细胞，按1×106个/瓶接种于50ml平底细胞培养瓶，预培养24 h。设置3个药物作用浓度，分别为300，550，1 000 μg·ml-1，同时做细胞阴性对照瓶（细胞和培养液）。加药后继续培养36 h。利用谷胱甘肽-s转移酶测定试剂盒对lovo肿瘤细胞谷胱甘肽-s转移酶进行测定。
2.7 lovo肿瘤细胞活性氧水平的检测
取对数生长期lovo细胞，按5×105个/瓶接种于24孔平底细胞培养板，预培养。设置3个药物作用浓度，分别为300，550，1 000 μg·ml-1，同时做细胞阴性对照孔（细胞和培养液）及阳性药物对照孔（活性氧阳性对照）。加药后继续培养24 h。利用活性氧检测试剂盒对人结肠癌lovo肿瘤细胞活性氧水平进行检测。
2.8 统计学方法定量分析
实验重复3次，实验数据均用±s表示，采用统计学软件进行处理，实验组与对照组用t检验。 3 结果
3.1 zaf对lovo细胞体外抗增殖作用的量效关系
mtt结果显示，寨卡有效部位提取物zaf对lovo细胞增殖的抑制作用具有浓度依赖性（图1），即药物浓度越大，对细胞的抑制越明显。作用48 h时其ic50为550μg·ml-1。
3.2 细胞死亡时质膜的变化（annexin v-fitc/pi染色）实验中采用凋亡细胞原位荧光染色的方法，通过比较同一位置的光镜照片和两种荧光激发波长染色照片，可以观察到细胞在受zaf影响后，出现凋亡和坏死的情况。阴性对照细胞生长良好，未见细胞凋亡。随着药物浓度的增加，细胞凋亡和坏死程度也随之增加，细胞总数逐渐减少。 阴性对照组，annexin v-fitc染色不见绿色荧光，说明细胞膜是完整的，未出现凋亡情况。而pi染色可见两个红色细胞，此为细胞过度生长导致的坏死。当药物浓度为300 μg·ml-1时，有部分细胞经annexin v-fitc染色可见明显的绿色荧光，且表现出细胞形态，说明已出现质膜破坏，磷脂酰丝氨酸的外翻，而用pi染色可看到有与绿色荧光重合的细胞和单独被染成红色的细胞。当药物浓度为550 μg·ml-1时，经annexin v-fitc染色可见明显的绿色荧光，但由于凋亡程度的加深，其细胞形态开始不明显，并出现破裂，而用pi染色可看到有与绿色荧光重合的细胞（细胞膜完整性被破坏的凋亡晚期细胞）和单独被染成红色的细胞（坏死细胞）。当药物浓度为1 000 μg·ml-1时，经annexin v-fitc染色可见明显的绿色荧光，且由于凋亡程度的进一步加深，细胞出现破裂，已基本看不出完整的细胞形态，而用pi染色可看到有与绿色荧光重合的细胞（细胞膜完整性被破坏的凋亡晚期细胞）和单独被染成红色的细胞（完全破裂的凋亡细胞或坏死细胞）。
3.3 zaf对人结肠癌lovo肿瘤细胞内caspase-3、caspase-9蛋白表达的影响
从图2中可看出，寨卡有效部位提取物zaf对caspase-3、caspase-9蛋白的表达有明显的促进作用，且该作用存在明显的剂量依赖关系，随着药物浓度的增加，caspase-3、caspase-9蛋白的表达增加明显。从该实验结果可知，寨卡有效部位是通过促进caspase-3、caspase-9蛋白的表达，从而达到其诱导细胞凋亡的作用。
3.4 zaf对人结肠癌lovo肿瘤细胞内谷胱甘肽（gsh）含量的影响
见图3。从图3中可看出，寨卡有效部位提取物对gsh有明显的耗竭作用，且该耗竭作用存在一定的剂量依赖关系，随着药物浓度的增加，gsh耗竭越多。寨卡有效部位提取物与gsh结合后，使gsh大量耗竭，改变了细胞的氧化还原状态，从而诱导lovo肿瘤细胞的凋亡。
3.5 zaf对人结肠癌lovo肿瘤细胞谷胱甘肽-s转移酶的诱导作用
见图4。从图4中可看出，寨卡有效部位提取物对gst有明显的诱导作用，且药物剂量越高，诱导作用越强，存在着量-效关系。
3.6 zaf对人结肠癌lovo肿瘤细胞内活性氧的影响
见图5。从图5可以看出，随着zaf剂量的增加，绿色荧光强度变大，ros 水平明显上调，ros上调与细胞凋亡程度一致。结果表明，zaf可通过累积细胞内ros 的浓度水平，诱导肿瘤细胞的凋亡。 阴性对照组，细胞形态良好，细胞未凋亡，绿色荧光的产生，基于细胞内存在h2o2，是活性氧在肿瘤细胞内的本底。当药物浓度为550 μg·ml-1时，细胞形态较好，凋亡不明显，但荧光强度比阴性对照组强，ros出现累积。当药物浓度为1 000 μg·ml-1时，细胞收缩，荧光亮度增加，并显示出其定位。从照片中定位的活性氧来看，凋亡细胞内ros水平随药物剂量的增加而显著升高。阳性对照组，可见强烈的绿色荧光及大量定位的活性氧。
4 讨论 本实验结果首先显示，寨卡有效部位提取物对lovo细胞具有明显抑制增殖及杀伤作用，可引起肿瘤细胞凋亡，并呈现剂量依赖关系，其ic50为550 μg·ml-1。该提取物可能通过多种机制发挥其抗肿瘤作用，本研究主要从该提取物对肿瘤细胞内谷胱甘肽、谷胱甘肽转移酶以及活性氧水等的影响来揭示其作用途径。 谷胱甘肽(gsh) 分还原型和氧化型两种，在生理条件下以还原型为主。其中，还原型谷胱甘肽是细胞内氧化还原状态的重要生物调节因子，对机体内的氧化损伤具有保护作用。目前，凋亡机制的最新研究发现细胞内谷胱甘肽(gsh)的水平与细胞凋亡密切相关，通过gsh的耗竭可以启动肿瘤细胞凋亡。本实验寨卡有效部位提取物对gsh有明显的耗竭作用，且该耗竭作用存在剂量依赖关系。与此同时，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞凋亡也与剂量呈依赖关系，可据此推断gsh的耗竭与细胞凋亡存在一定联系。 谷胱甘肽-s转移酶是由多个基因编码、具有多种功能的超基因家族酶，是多种生物体内的主要解毒系统，可解除脂质和dna氢过氧化物的毒性，保护正常细胞免受致癌和促癌因素的影响，在抗肿瘤中起重要作用［6，7］。实验结果显示，寨卡有效部位提取物对gst有明显的诱导作用，从而加速细胞凋亡的发生。
活性氧亦称氧自由基，肿瘤发生与活性氧过量产生有关。o2、o2-和某些有机羟过氧化物都是促癌剂或弱的完全致癌剂。然而，一定量的活性氧作为机体的防御系统，可以保护机体免受有害物质的侵扰。许多研究也显示活性氧与细胞凋亡密切相关［8］。macho等［9］在研究胸腺细胞凋亡机制中发现，早期凋亡细胞内ros含量轻度升高。而阿霉素作为临床上广泛使用的抗肿瘤药物，主要是通过诱导活性氧自由基的产生，使细胞的还原状态发生改变而影响细胞生理状态杀死肿瘤细胞。本文的实验研究结果表明，寨卡有效部位提取物zaf与肿瘤细胞作用，导致gsh耗竭，直接激活caspase-3而诱导细胞凋亡。 经典的化疗药物通过核酸和微管损伤诱导肿瘤细胞凋亡，大多作用于线粒体信号传导的上游阶段，而gsh 的耗竭不论是以ros为介导还是直接启动细胞凋亡，都是直接作用于线粒体，从理论上能够绕过线粒体凋亡信号传导的上游阶段，直接诱导肿瘤细胞凋亡，从而可以克服由于信号传导障碍引起的抗肿瘤药物的多药耐药性问题。 寨卡有效部位提取物为硫代葡萄糖苷类物质，水解后生成异硫氰酸酯类化合物，由于该类化合物可与gsh 结合形成氨基二硫代甲酸酯物质，引起细胞内ros蓄积，诱导人肿瘤细胞的凋亡。因此寨卡有效部位抗大肠癌的作用靶点即是肿瘤细胞的线粒体，寨卡有效部位提取物zaf是通过直接作用于肿瘤细胞线粒体来诱导细胞凋亡，起到抑癌作用。本研究发现，寨卡有效部位提取物可以明显抑制肿瘤细胞生长，并可通过多途径引起细胞凋亡，因此对于抗肿瘤药物的开发有重要的实际意义。
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