内容
作者：舒奇，傅颖媛 刘婷，余燕影
【摘要】 目的研究金边瑞香活性成分瑞香黄烷-ⅰ(e002)、瑞香素(e003)抗肿瘤活性，为进一步研究抗肿瘤机制提供依据。方法用噻唑蓝(mtt)法检测不同浓度e002、e003对smmc-7721和mcf-7细胞的抑制率。结果①e002、e003浓度为250～1.95 μg/ml时,作用smmc-7721细胞，两者的抑制率为：(86.9±2.2)%～(50.8±0.6)%。 ②e002浓度为250～62.5 μg/ml时,作用mcf-7细胞，其抑制率为：(72.3±2.1)%～(52.48±1.65)%。 ③e002对smmc-7721和mcf-7细胞的ic50值分别为：(1.96±0.03)和(22.89±3.04) μg/ml;e003对smmc-7721细胞的ic50值为：(1.23±0.11) μg/ml。结论金边瑞香活性成分瑞香黄烷-ⅰ对smmc-7721、mcf-7细胞,瑞香素对smmc-7721细胞的增殖均有显著抑制作用，且呈现良好的剂量依赖性。
【关键词】 金边瑞香; 抗肿瘤; 噻唑蓝法
abstract：objectiveto study the antitumor activity of daphne odor var.marginata extracts-e002 (daphnodorin i) and e003(daphnetin ) in vitro. methodsmcf-7 and smmc-7721 cells were treated respectively with e002 and e003 at different concentrations, the growth inhibitory effects of e002, e003 were assessed using the mtt assay .results(1)both inhibition rate (%)were from 86.9 ± 2.2 to 50.8 ± 0.6,when smmc-7721 cells were treated with e002, e003 in the concentration range of 250～1.95(μg/ml).(2) inhibition rate (%)were from 72.3±2.1 to 52.48±1.65,when mcf-7 cells were treated with e002 in the concentration range of 250～62.5 (μg/ml).(3)ic50 value e002 on smmc-7721 and mcf-7 cells (μg / ml) were 1.96 ± 0.03 and 22.89 ± 3.04;ic50 value e003 on smmc-7721 cells (μg / ml) was: 1.23 ± 0.11. conclusiondaphnodorin i has significant inhibitory effect on mcf-7 and smmc-7721 cells in a dose-dependent in vitro.daphnetin has significant inhibitory effect on smmc-7721 cell in a dose-dependent in vitro.
key words：daphne odor var.marginata ; antit umor; mtt assay
金边瑞香(daphne odora var.marginata)，又名睡香，具有抗炎、抑菌、镇痛、调节免疫、抗缺氧、抗脂质过氧化延缓衰老等药理活性[1～7]，其主要活性成分为双黄酮类和香豆素类化合物[8]。wwW.11665.COm本研究中所用瑞香黄烷-ⅰ(e002)、瑞香素(e003)系从金边瑞香中提取的两种单体化合物，前者为双黄酮类化合物，后者为香豆素类化合物。本研究观察了 e002 、e003对两种人实体瘤细胞——人肝癌smmc-7721细胞及人乳腺癌mcf-7细胞的增殖抑制作用，为进一步研究抗肿瘤机制提供依据。
1 材料
1.1 药物药物 e002(瑞香黄烷ⅰ，daphnodorin i，纯度99.7%)和e003(瑞香素，daphnetin，纯度99.6%)均为由南昌大学分析化学系采用高速逆流色谱技术从金边瑞香中进行分离纯化并提供的单体化合物(分子结构见图1)。其中瑞香黄烷ⅰ是首次从该种植物中分离得到。药物浓度均为1 mg/ml，临用前用1640培养液行12个梯度倍比稀释，使终浓度为250，125，62.5，31.25，15.62，7.81，3.90 ，1.95，0.97，0.48，0.24，0.12 μg/ml。
图1 e002、e003分子结构
1.2 细胞 mcf-7细胞株购自南京凯基生物公司，smmc-7721细胞株由江西省医学科学研究所提供，采用常规培养, 培养液为含10%小牛血清的rpmi1640，在37℃, 5%co2饱和湿度的孵箱中培养, 细胞处于对数生长期时用于实验。
2 方法
2.1 细胞培养 将细胞复苏后，接种于已加有6～7 ml含1640完全培养液的细胞培养瓶中，置于37℃，5%co2 的培养箱中培养，每两天换液一次，当细胞生长至密度70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。待细胞养至第3代后，消化细胞调整到所需浓度备用。
2.2 抑瘤实验采用mtt比色法，取1.0×105 /ml的对数生长期细胞，以每孔100 μl接种于96孔培养板中。12 h后，于各实验孔中加入不同浓度相应药物100 μl/孔，每个浓度设3个平行孔;同时设阳性对照孔(加入12.5 μg/ml阿霉素)、细胞对照孔、溶剂对照孔和空白对照孔。培养至44 h时，每孔加入5 mg/ml的mtt 20 μl。继续培养4 h后，弃去全部上清，每孔加入150 μl二甲基亚枫(dmso) ，振荡后，在酶标仪492 nm波长处测od值，实验重复两次。然后计算细胞生长抑制率：抑制率(% ) = (1 - 加药孔平均od值/对照孔平均od值)×100%;然后计算出半数抑制浓度(ic50)。
2.3 统计学方法 采用spss 13. 0统计软件，进行统计学分析。 3 结果
e002、e003为250，125，62.5，31.25，15.62，7.81，3.90，1.95μg/ml浓度时，作用于smmc-7721细胞，前者的抑制率(%)为：85.13±3.72，83.06±0.56，80.88±1.67，74.23±1.12，67.63±0.90，62.58±1.09，56.15±1.68，50.8±0.63;后者的抑制率(%)为：86.9±2.23，83.4±2.47，80.35±2.22，78.01±0.41，74.53±3.46，69.05±2.83，60.01±2.68，51.46±1.63。见图2a。 取e002为：250，125，62.5 μg/ml浓度时，作用于mcf-7细胞，其抑制率(%)为：72.3±2.10，54.31±2.43，52.48±1.65。(见图2b);e003对mcf-7细胞增殖抑制作用不明显。
e002作用于smmc-7721和mcf-7细胞的ic50值(μg/ml)分别为：1.96±0.03和22.89±3.04;e003作用于smmc-7721细胞的ic50值(μg/ml)为：1.23±0.11。
4 讨论
瑞香素(daphnetin)系香豆素类化合物，具有强心、抗血栓形成、镇痛、抗炎、镇静催眠、抗疟疾、杀蚜虫及抗菌等多种作用。瑞香黄烷ⅰ系双黄酮类化合物。已有研究表明：双黄酮类化合物和香豆素类化合物均具有良好的抗肿瘤活性[9，10]。但关于瑞香黄烷-ⅰ和瑞香素的抗肿瘤活性却鲜有报道。本实验采用mtt法，用从我省盛产植物金边瑞香中提取的瑞香黄烷ⅰ和瑞香素作用于人的两种实体瘤细胞——人肝癌smmc-7721细胞及人乳腺癌mcf-7细胞，观察其是否具有抗肿瘤作用。结果表明瑞香黄烷-ⅰ对smmc-7721、mcf-7细胞,瑞香素对smmc-7721细胞的增殖均有显著抑制作用，且呈现良好的剂量依赖性;瑞香素对mcf-7细胞抑制作用不明显。提示瑞香黄烷ⅰ和瑞香素均具有一定的体外抗肿瘤活性，其具体抗瘤机制还有待进一步深入研究，而其抗肿瘤作用是否具有实用价值，还需动物试验进一步证实。
【参考文献】 [1] 叶和杨，曾 靖，杨敬格，等.金边瑞香的抗炎症作用[j].赣南医学院学报，2002，22(1)：7. [2] 徐 静，傅颖媛.金边瑞香对小鼠免疫细胞的影响[j].广东医学，2005，26(9)：1207. [3] 叶和杨，曾 靖，胡 晓，等.金边瑞香的耐缺氧作用[j].赣南医学院学报，2002，22(4)：329. [4] 叶和杨，汪秀荣，胡志萍，等.金边瑞香对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[j].赣南医学院学报，2005，25(5)：579. [5] 叶和杨，熊小琴，王中平，等.金边瑞香提取液镇痛作用的实验研究[j].赣南医学院学报，2004，24(5)：505. [6] 叶和杨，周 俐，曾 靖，等.金边瑞香对小鼠sod活性及mda含量的影响[j].赣南医学院学报，2003，23(3)：246. [7] 陈水亲，徐 静，黄彬红，等.植物药金边瑞香对小鼠肠道peyer's法的影响[j].中国临床康复，2006，10(3)：85. [8] 张 薇.三种瑞香药用植物的活性成分研究[d].2006. [9] 郑继发，高小文，古 奇，等.瑞香芫花根中瑞香黄烷的抗肿瘤活性[j].国际免疫药理学，2007，7:128. [10] mizuno a,takata m.angelical edulis中新三香元素结构及其抗肿瘤活性[j].药用植物，1994，60：333.