内容
【摘要】 目的 在蛋白及mrna水平确定过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxiome proliferatoractivated receptorγ, pparγ）在大肠肿瘤中的表达。方法 结肠镜下活检标本，分为正常大肠粘膜组、大肠腺瘤组及大肠癌组，免疫组化及rtpcr方法检测各组pparγ的表达。结果 正常大肠粘膜中表达pparγ蛋白的细胞主要是接近肠腔，分化良好的腺上皮细胞；而在大肠腺瘤中，pparγ阳性的细胞呈弥漫分布。pparγ蛋白及mrna在大肠癌中的表达显著增加，明显高于大肠腺瘤和正常大肠粘膜(p 0.05)。pparγ蛋白及mrna在正常大肠粘膜及腺瘤中的表达无差异（p 0.05）。pparγ mrna在重度异型增生腺瘤中的表达高于正常大肠粘膜(p 0.05)，接近于在大肠癌中的表达（p 0.05）。结论 大肠腺瘤最先发生pparγ表达部位的变化,pparγ在重度异型增生的大肠腺瘤及大肠癌中的表达水平较高，表明pparγ可能在早期即参与大肠癌的发生发展。 【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 大肠腺瘤 大肠癌 大肠癌多数由大肠腺瘤演变而来，其发生的经典多步骤模式为“腺瘤—腺癌序列”。过氯化物酶体增殖物激活受体γ(peroxiome proliferatoractivated receptorγ,pparγ)是由配体激活的核转录因子ppars的一个亚型，与消化道肿瘤关系密切。wwW.11665.cOM有研究发现pparγ在大肠粘膜细胞中有表达，本研究旨在蛋白水平和mrna水平确定大肠肿瘤中pparγ的表达情况。 1 材料与方法 1.1 材料收集、分组 所有组织均取自北医三院消化科结肠镜下活检标本，并经病理诊断证实。正常大肠粘膜15例、大肠腺瘤16例及大肠癌上皮15例行免疫组织化学染色。正常大肠粘膜24例、大肠腺瘤58例(其中重度异型增生大肠腺瘤14例)及大肠癌上皮38例行rtpcr。 1.2 pparγ的免疫组化染色 组织取材后于福尔马林中固定、脱水、常规石蜡包埋、切片（厚4μm）→铺于多聚赖氨酸涂布的载玻片上→常规脱蜡至水→0.1m pbs浸泡5min→抗原修复（0.1m枸橼酸盐缓冲液预热至92℃～98℃，放入玻片，微波炉内92℃～98℃加热5min，自然冷却至室温）→0.1m pbs冲洗5min→3%过氧化氢孵育10min，消除内源性过氧化物酶活性→0.1m pbs冲洗5min→滴加封闭用正常山羊血清（北京中山生物科技公司），室温孵育15min，倾去→滴加1∶20稀释的鼠抗人pparγ单克隆抗体(一抗，santa cruz 生物技术公司，美国)，4℃过夜。→0.1m pbs冲洗5min→滴加生物素标记羊抗小鼠igg（二抗，北京中山生物科技公司），37℃孵育15min→0.1m pbs冲洗5min→滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（北京中山生物科技公司），37℃孵育15min→0.1m pbs冲洗→dab显色，自来水充分冲洗→苏木素复染后封片。阴性对照用正常山羊血清代替一抗。 pparγ阳性反应表现为细胞核和胞浆呈棕褐色。每张切片选取3～5个视野，用《真彩色病理图像分析系统 4.0》（北航图像中心）对免疫组化染色结果进行分析，计算面密度(阳性目标总面积/统计场总面积)，并进行统计。 1.3 rt pcr trizol（invitrogen公司）提取组织总rna，适量depc水溶解后，分光光度计（uv1601，shimadzu）测od260 及od280的值及电泳测定rna浓度及纯度；各取2μg的rna，impromiirt试剂盒（promega公司）将rna逆转录为cdna；taq dna聚合酶（北京泛基诺科技有限公司）作用下进行pcr反应（pcr仪为geneamp9700， 美国applied biosyetems公司）。反应条件见表1。 阴性对照不加逆转录酶，代以去离子水，余反应条件同前。 内参βactin及目的基因pparγ的pcr产物各6μl于1.5%琼脂糖凝胶75v/cm恒压电泳，eb染色后在紫外灯下观察，清晰见341bp和500bp的条带，在imagemaster凝胶成像系统仪（quantity 0ne，美国柯达公司）下分析。pparγ与βactin电泳条带灰度的比值代表各组pparγ的表达水平。 1.4 统计学分析 结果用±s表示。采用spss11.0软件分析。计量资料的组间比较采用单因素方差分析，p 0.05认为差异有统计学意义，p 0.01认为差异极具统计学意义。 2 结果 2.1 pparγ 蛋白在人正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中的表达 免疫组化结果显示：在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中均有pparγ的表达。正常大肠粘膜组织中表达pparγ的细胞主要是接近肠腔、分化良好的腺上皮细胞，见图1a；而在大肠腺瘤组织中，pparγ阳性细胞的分布发生异常，分布的极性消失，呈弥漫分布，见图1b。pparγ蛋白在正常大肠粘膜及腺瘤中的表达差异无统计学意义(p 0.05)。 pparγ蛋白在大肠癌细胞中高表达，见图1c, 明显高于在大肠腺瘤及大肠粘膜中的表达 (p 0.01) ，见表2。表2 pparγ蛋白在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中的面密度(阳性目标总面积/统计场总面积） 2.2 pparγ mrna 在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌上皮中的表达 rtpcr结果显示：大肠癌中的pparγ mrna的表达水平最高，明显高于正常大肠粘膜和大肠腺瘤，与两者相比，差异均有统计学意义（p均 0.01）；pparγ在正常大肠粘膜和大肠腺瘤中的表达差异无统计学意义（p 0.05），见表3，图2。 2.3 pparγ mrna在正常大肠粘膜、重度异型增生大肠腺瘤及大肠癌中的表达 rtpcr结果显示：重度异型增生腺瘤中pparγ mrna的表达高于正常大肠粘膜，两者间差异有统计学意义(p 0.05)，但与大肠癌中pparγ的表达差异无统计学意义（p 0.05），见表4。表1 pparγ pcr扩增反应条件 扩增基因反应体系cdna模板引物序列退火温度循环次数产物大小pparγ25μl2μl上游: 5′atgacagcgacttggcaata3′50°c40341bp下游: 5′gcaactggaagaagggaaat3′βactin25μl1.5μl上游: 5′gtggggcgccccaggcacca3′55℃25500bp下游: 5′ctccttaatgtcacgcacgat3′ 图1 pparγ蛋白在正常大肠粘膜(a)、大肠腺瘤(b)及大肠癌中的表达(c) m:marker;control:阴性对照;n:正常大肠粘膜;a:大肠腺瘤;c:大肠癌表3 pparγ在正常大肠粘膜、大肠腺瘤 3 讨论 pparγ是由配体激活的核转录因子ppars的一个亚型，亚油酸、花生四烯酸，15脱氧－△12，14－前列腺素j2(15d－pgj2) 是其天然配体，噻唑烷二酮类药物（tzd）、某些非甾体类抗炎药（nsaids），如舒林酸为其合成配体。pparγ的生物学功能复杂，在调控脂肪和糖代谢、脂肪细胞及单核细胞分化成熟、炎症反应、诱导肠细胞分化及肿瘤细胞的分化和凋亡中起重要作用。 已证实，pparγ在脂肪细胞中高表达，近期数据表明大肠中pparγ的表达水平与脂肪细胞中相似[1,2]。mansen[1]等免疫组化及western实验发现鼠大肠和小肠粘膜均表达pparγ。而且，pparγ在朝向管腔分化好的大肠粘膜细胞中表达水平较高，大肠中pparγ mrna的表达也高于小肠。lefebvre[3]等的研究发现啮齿动物和人类大肠中pparγ mrna及蛋白的表达水平高于小肠，而且pparγ都分布在分化较好的大肠粘膜细胞中。在 caco2和ht29人大肠腺癌细胞系中，pparγ的表达随分化级别的增高而增加，说明pparγ表达水平与大肠上皮细胞的分化表型有关。此外，在多种小肠肿瘤的小鼠中，pparγ在大肠中的表达也高于小肠[4,5]。这些结果表明肠道粘膜中存在pparγ，但它同大肠肿瘤的关系尚不明了。 最近的研究显示，pparγ的代表性配体－噻唑烷二酮具有抑制pparγ阳性的大肠癌细胞系ht29的生长和转移的作用[6]。而且，pparγ的配体可以促进多种细胞，包括大肠癌细胞的凋亡，并促进其分化及生长抑制[7]。可见，pparγ与大肠肿瘤的关系密切。 我们的研究显示：pparγ主要在朝向大肠管腔的分化好上皮细胞中表达，同国外的研究结果相同[1,3]。pparγ蛋白及mrna在正常大肠粘膜与大肠腺瘤无明显差别。然而，pparγ蛋白在大肠腺瘤中弥漫分布，可见于腺窝底部分化不好的上皮细胞中。同时，pparγ蛋白及mrna在大肠癌中高表达，明显高于正常大肠粘膜及大肠腺瘤中的表达。这些数据表明pparγ表达异常可能是大肠癌发生的早期事件，首先发生pparγ表达部位的异常，随后出现表达量的异常。我们研究显示重度异型增生腺瘤中pparγ mrna表达接近于大肠癌中的表达也支持这一假设。我们的结果同houseknecht[7]、dubois[8]和su[9]的结果一致。 然而，大肠肿瘤中pparγ升高的原因尚不明确。chen[10]等考虑大肠肿瘤中pparγ的高水平表达为代偿性的。已证实大肠癌中抗凋亡基因bcl2的表达升高，使大肠癌细胞凋亡减少而起到促进肿瘤生长的作用。同时，越来越多的证据说明激活pparγ后促进癌细胞的凋亡[1113]，即pparγ和bcl2在大肠癌中的作用相反，两者在维持细胞的增殖、分化和凋亡的平衡中存在相互制约的关系。chen的研究[11]提示大肠肿瘤中pparγ内源性配体存在缺陷，在无外源性配体存在的情况下，pparγ不能被充分激活。大肠肿瘤中高表达的pparγ不能充分发挥其促凋亡作用，而高水平表达的bcl2却可以抑制大肠肿瘤的凋亡，为了与升高的bcl2维持制约平衡，大肠肿瘤中pparγ进一步代偿性升高。另外，park等[14]认为，在腺瘤样大肠息肉易感基因（apc）突变的大肠癌细胞中，ppars的另一个亚型——pparβ的表达也增加，而pparβ和pparγ竞争性结合维甲酸x受体（rxr）进而发挥其转录作用。因此，为了充分发挥作用，大肠癌细胞中pparγ水平升高。 总之，pparγ表达部位的变化首先见于大肠腺瘤，重度异型增生的腺瘤及大肠癌中pparγ的表达水平较高。这些数据表明pparγ可能在大肠癌发生的早期起作用，pparγ表达水平的升高有可能成为大肠肿瘤的表型标志。 【参考文献】 ［1］ mansen a, guardioladiaz h, rafter j,et al. expression of the peroxisome proliferatoractivated receptor (ppar) in the mouse colonic mucosa[j]. biochem biophys res commun，1996,222(3):844851. 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