内容
作者：胡泽华，郜邦鹏，黄德斌
【摘要】 目的探讨马棘70％醇提取物（ipm）的抗动脉粥样硬化作用及机制。方法用不同浓度的马棘、肝素孵育体外培养的小鼠单核巨噬细胞raw264.7 12 h后，加入氧化低密度脂蛋白（ox-ldl ）作用，用免疫组化和逆转录聚合链反应（rt-pcr）分别检测ipm对低密度脂蛋白受体（ldl-r）蛋白和mrna表达的影响。结果马棘能明显降低小鼠单核巨噬细胞raw264.7的ldl-r蛋白和mrna 表达，且对ox-ldl引起的ldl-r表达降低有保护作用。结论马棘具有降低巨噬细胞ldl-r的表达和逆转ox-ldl的作用，这可能是其抗动脉粥样硬化的重要作用机制。
【关键词】 马棘 巨噬细胞 低密度脂蛋白
abstract：objectiveto explore the antiatherogenic mechanism of alcohol extract from indigofera pseudotinctoria matsum (ipm). methodsthe cell was incubated with different concentration of ipm or heparin for 12 h that was established by culturing mouse macmphage raw264.7, then ox-ldl was added into culture plate. the experiment was terminated after ox-ldl took action for 24 h. the expressions of ldl-r protein and mrna were determined by immunohistochemistry or rt-pcr, respectively. resultsthe expression of ldl-r protein and mrna in mouse macrophage raw264.7 was reduced after being incubated with ox-ldl for 24 h .ipm reinforcemented the expressions of ldl-r protein and mrna which were reduced by ox-ldl . conclusionox-ldl can inhibit the expression of ldl-r protein and mrna in macrophage. ipm can reverse this effect of ox-ldl . this may be one of antiatherogenic mechanism.
key words： indigofera pseudotinctoria matsum (ipm)； macrophage ； low density lipoprotein 马棘（indigofera pseudotinctoria matsum，ipm）为豆科木篮属植物，以根或全株入药。www.11665.coM又名一味药、野绿豆、马料梢、山皂角、野篮枝子。性味苦、涩，平，具有清热解毒、消肿散结之功效。用于感冒咳嗽，扁桃体炎，颈淋巴结结核，小儿疳积，痔疮；外用治疔疮。该植物广泛分布于全国各省市，资源丰富［1～3］。我们曾研究发现马棘醇提取部位具有显著镇痛作用［4］。本研究探讨70%马棘醇提物（ipm）对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
gibco公司dmen培养基和小牛血清；抗ldl-r多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；ldl（中国协和医科大学基础生化所）；大连宝生物工程有限公司逆转录系统和pcr core system；引物（武汉博士德生物工程有限公司）；小鼠单核巨噬细胞raw264.7（中国协和医科大学细胞中心）；其他试剂为国产分析纯。上海第三分析仪器厂722 型分光光度计；日本 olympus 公司xdp-1倒置显微镜；sheldon lab 公司tc 2323 型co2 培养箱；依地酸（edta，sigma公司），3,3二氨基联苯胺（dab）。
1.2 马棘醇提取物的制备［5］
马棘枝叶采自湖北建始，经湖北民族学院鲁开功教授鉴定为豆科植物马棘（indigofera pseudotinctoria matsum，ipm），经10倍量70%乙醇回流提取两次，过滤，浓缩蒸干，研末，收率为14.3%。
1.3 小鼠单核巨噬细胞raw264.7的培养［6，7］
细胞培养瓶中接种raw 264.7，调至ph 7.2～7.4，含胎牛血清10％、链霉素l×105 u·l-1、青霉素1×108 u·l-1的dmen培养液，通以5 % co2恒温37℃培养48～72 h，细胞融合后，用0.1％胰蛋白酶和edta0.08 %的混合消化液消化传代。实验前将细胞接种于细胞培养板，在无血清、无酚红的培养液中通以5 % co2，37℃，培养12 h备用。
1.4 氧化低密度脂蛋白（ox-ldl）的制备［6,7］
将ldl置于恒温37℃、ph 7.2的pbs溶液（cuso4，10 μmol·l-1）透析24 h，在含0.1 % edta的pbs中透析24 h终止反应，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。脂蛋白氧化修饰程度以硫代巴比妥酸反应物质值来表示。结果ox-ldl为 21.4 μmol·l-1，ldl为 2 .2 μmol·l-1，说明ldl被氧化。
1.5 动物分组共分6组，即：对照组（control group,cg）；ox-ldl组（ox-ldl group,olg）；肝素组（100 mg·l-1,heparin group,hpg）；ipm 100，200，400 mg·l-1保护组（ipm-100,200,400）。取细胞计数为1×108个细胞·l-1的备用传代培养细胞，按每孔500μl 接种于6孔板，每组5孔，12 h细胞融合后，更换无血清无酚红dmen培养液，后4组（hpg和ipm-100,200,400）分别加入相应浓度的肝素和ipm预处理，培养12 h后，除cg外，其余各组分别加入50 mg·l-1ox- ldl培养 24h 获细胞。
1.6 ldl-r表达的检测（免疫酶标记法，sabc）［6］
取细胞爬片，内源性过氧化酶以3% h2o2灭活，用羊血清封闭，加兔抗鼠ldl-r一抗，4℃，次日加山羊抗兔lgg二抗；加sabc复合物，dab-h2o2显色。脱水、透明、封片，镜下观察，阳性物呈棕黄色。以德国欧波同vidas图像分析系统分析实验结果，小鼠单核巨噬细胞raw264.7 中ldl-r相对含量以细胞平均吸光度a值表示。
1.7 ldl-r mrna表达的检测（逆转录聚合酶链反应，rt-pcr）［7］
按trizol试剂说明一步法提取各组细胞总rna。取总rna 4 μl按试剂说明逆转录合成cdna，取2 μl加入25 μl反应体系扩增，pcr扩增条件为：94℃，5 min；94℃，45 s；52℃,45 s , 72℃，1 min, 30个循环，72℃10 min。扩增后的ldl-r上游引物：5 ' tcc atc ttc ttc cct att gc 3 '，下游引物：5 ' cag ccc agc ttt gct cta 3 '，合成360 bp片断。内参照β-肌动蛋白上游引物：5 ' tat cct ctc cct cac ccc atc3 '，下游引物：5 ' tca gta aca ctc cgc cta caa3 '，合成639 bp片断pcr产物。用1％琼脂糖凝胶电泳显影，结果用天方凝胶图象分析软件分析，各组ldl-r mrna 表达差异定量用各组目的基因与内参照基因的吸光度（a）比值来表示。
1.8 统计学分析各组数据采用±s表示，配对比较采用t检验。
2 结果
2.1 ipm对raw264.7细胞ldl-r mrna
表达的影响各组细胞均有ldl-r mrna 表达，ox-idl与小鼠单核巨噬细胞raw264.7作用24h后，能明显降低ldl-r的mrna表达，与cg比较，有显著性差异（p 0.01）；ipm-100,200,400 mg·l-1均能提高ldl-r mrna的表达，且呈现浓度依赖趋势，以ipm-400 mg·l-1作用最强，与ipm-100和200 mg·l-1对比有显著性差异（p 0.05或p 0.01）.结果见图1及表1。表1 ipm对raw264.7细胞ldl-r mrna表达的影响（略） 2.2 ipm对raw264.7细胞ldl-r蛋白表达的影响
ldl-r免疫组化结果显示，各组细胞均有ldl-r表达，表达强弱有明显差别；ox-ldl与 raw264.7细胞作用24 h后能显著降低 ldl-r蛋白表达，与cg比较有显著差异（p 0.01）；ipm对ox -ldl引起的ldl-r表达下调均有保护作用，以400 mg·l-1组作用最强，与ipm-100和200 mg·l-1对比有显著性差异（p 0.01）；肝素（100 mg·l-1）对ox-ldl引起的ldl-r表达下调无明显作用，与cg相比无显著差异（p 0.05）。结果见表2。表2 ipm对raw264.7细胞ldl-r 蛋白表达的影响（略）
3 讨论 动脉粥样硬化（as）是心脑血管疾病的主要病理基础，其主要成因与脂质代谢紊乱有关［8］。流行病学及实验研究发现，血浆低密度脂蛋白（ldl）浓度与as的发生呈正相关［9］。最新研究发现，ldl受体（ldl-r）对调节体内的胆固醇平衡，降低血浆ldl浓度起关键性作用，因而ldl-r功能的缺陷和异常是引起脂质代谢紊乱主要原因［10］。ldl-r是一种细胞表面糖蛋自，能与血浆中两种致as脂蛋白（ldl和vldl）结合，介导内吞和胞内分解，所以ldl-r对调节血浆总胆固醇（tc ) 含量起着关键作用［11］。因此，通过调控ldl-r的活性控制高脂血症，可以预防as的发生与发展［9］。ldl-r基因表达调控的分子机制是：转录水平ldl-r基因启动子的激活和抑制、胆固醇类分子的负反馈抑制以及转录后mrna分子稳定性的提高与降低［10］。ldl-r 基因转录的调控主要由胞内胆固醇（负反馈抑制性机制）和非胆固醇分子介导，前者涉及胆固醇调节元件结合蛋白（srebp1和srebp2）的合成及与ldl - r基因启动子胆固醇调节元件（sre1）的结合［11］。当胆固醇浓度降低时，srebp便结合到sre1上，激活ldl-r基因转录，这一机制对于保持细胞的胆固醇平衡有重要意义［10］。非胆固醇介导的调控机制则通过蛋白激酶mek/erk信号转导进行，并与ldl-r基因启动子中的重复序列3有关［9］。 本研究发现ox-ldl可降低ldl-r表达，与有关报道一致［8］。其机制可能为细胞摄取 ox-ldl后，使胞内胆固醇浓度升高，通过由胆固醇介导的负反馈抑制性机制，抑制了 srebp与srei结合，进一步抑制ldl-r转录与翻译［10］。ipm可逆转ox-ldl对ldl-r的下调，而且呈现浓度依赖趋势。其作用机制可能是：抑制泡沫细胞的形成，降低胞内胆固醇含量有关［9］，即通过降低胞内胆固醇含量，减少胆固醇介导的对ldl-r表达的负反馈抑制性，而增加ldl-r的表达［10］；ipm也可能通过蛋白激酶mek/erk信号转导途径，干扰ldl-r的转录所致［11］。这可能是其抗as的作用机制之一，其详细的作用机制尚有待于进一步探讨。
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