内容
作者：朱启江 作者单位：解放军第81医院 妇产科 ,江苏 南京 210002
【摘要】 目的 建立子宫内膜异位症的种植动物模型，了解正常在位子宫内膜、腺肌症的子宫内膜及卵巢巧克力囊肿内壁组织在裸鼠体内的生长的差异。方法 将正常子宫内膜、子宫腺肌症患者的内膜及卵巢巧克力囊肿内壁分别注射到裸鼠腹腔内，观察生长情况，留取标本行病理及免疫组化检查。结果 3种种植物中以卵巢巧克力囊肿内壁最易种植成功，其次是子宫腺肌症患者的内膜，正常子宫内膜种植成功率低于前两者。免疫组化结果提示3组种植成功的腺上皮上均有雌激素受体表达，孕激素受体弱表达或不明显，血管上皮生长因子表达明显。结论 腺肌症的子宫内膜及卵巢巧克力囊肿内壁组织在裸鼠体内更易生长，与正常内膜有差异;裸鼠体内种植腺体上皮及基质均见明显血管上皮生长因子表达。裸鼠子宫内膜异位症的动物模型成功建立，为研究子宫内膜异位症的发病机理和药物治疗提供了实验动物模型。
【关键词】 子宫内膜异位症; 子宫腺肌症; 巧克力囊肿; 疾病模型，动物
Human uterine endometrium and endometiotic tissue transplanted into nude mice to establish an animal model of endometriosis ZHU Qijiang.(Department of Gynecology and Obstetrics, 81st Hospital of PLA,Jiangsu 210002，China)
【Abstract】 Objective To establish the implanted animal model of human endometriosis.Methods The eutopic endometrium of normal women and patients of endometrioma, and the inner tissue of the cystis of ovarian endometriosis were implanted into the abdomen of nude mice respectively. Its growing condition was observed and the specimen was saved for pathology and immunohistochemistry examination .Results Of the three tissues, the eutopic endometrium of patients of endometrioma grew most easily. The second wes the inner tissue of the cystis of ovarian endometriosis . The successful implantation rate of the the eutopic endometrium of normal women into the nude mice was the lowerest.Immunohistochemistry examination showed that oestrogen receptors were expressed in the glandular epithelia and in stromal cells of endometriotic lesions of the three groups, whereas progesterone receptors were weakly expressed or not expressed .The vascular endothelial growth factor (VEGF) was clearly observed in both the glandular epithelia and stromal cells of grafts of the three groups.Conclusion The eutopic endometrium of patients with endometrioma and the inner tissue of the cystis of ovarian endometriosis are different from the eutopic endometrium of normal women . They could be more successfully transplanted into nude mice . The successful establishment of the animal model of endometriosis can provide an ideal model for the further investigation of the mechanisms and medical therapy of endometriosis.
【Key words】 Endometriosis; Endometrioma; Cystis of ovarian endometriosis; Disease models,animal
子宫内膜异位症是一种具有侵袭性的妇科常见病，近年来其发病率明显上升，痛经、不孕作为其主要临床表现，严重韦与利巴韦利治疗，均取得了较好的疗效。研究显示神经氨酸酶抑制剂奥司他韦对甲H1N1流感有效。但是应用利巴韦利治疗的患者也取得了同样的疗效，提示甲H1N1流感病毒对机体有自限性，或者说用利巴韦林也有一定的疗效，可能与利巴韦林为广谱抗病毒药，其进入被病毒感染的细胞后迅速磷酸化，其产物作为病毒合成酶的竞争性抑制剂，损害病毒的RNA和蛋白的合成，使病毒的复制和传播受抑有关。本资料也提示轻症甲型H1N1流感患者无需应用奥司他韦。
影响患者的生活质量。目前关于子宫内膜异位症的发病机制尚未最终阐明，药物治疗和术后复发率较高。由于伦理学问题，很难在人体中进行内膜异位症的对照研究，更不能反复进行创伤性检查。为了研究子宫内膜异位症的发病机理和观察药物治疗效果，需在动物体内复制出子宫内膜异位症，建立实验动物模型。裸鼠是一种免疫缺陷性小鼠，将异体组织种植于小鼠体内很少发生排斥反应，且价格适中，来源丰富，是建立子宫内膜异位症模型的理想动物。我们用裸鼠成功建立了子宫内膜异位症模型，为进一步探讨子宫内膜异位症发病机理、表现方式和鉴定治疗的新方法奠定了基础，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 标本来源：正常增生期子宫内膜来自40岁取环的门诊妇女;子宫腺肌症在位宫内膜和卵巢巧克力囊肿内壁组织来自一位36岁的手术患者。子宫内膜均经病理证实为增生期内膜。实验动物：裸鼠，雌性，5～6周龄，体重19～26 g，共20只，由上海实验动物中心提供，SPF(specificpathogen free)条件下饲养。
1.2 方法
1.2.1 标本处理 标本取材后放入含平衡液的无菌瓶中，置冰盒内，快速送实验室(1 h内，否则影响接种成功率)[1]用无菌的平衡液漂洗3次，尽量洗去血块和黏液，然后于无菌器皿中将其剪成1 mm×2 mm×1 mm大小的片状物，分装在盛有2 ml生理盐水的带12针头的无菌注射器中，每个注射器中含内膜片12片(在1 h内完成，否则影响内膜细胞的存活) 。每次依正常子宫内膜、子宫腺肌症患者的内膜及卵巢巧克力囊肿内壁组织顺序处理标本。
1.2.2 动物处理 于小鼠腹部正中脐下方消毒后穿刺入腹腔，注入组织碎片及生理盐水。于当天开始于小鼠腿部肌肉注射苯甲酸雌二醇0.02 ml(2 mg/ml)，1次/3 d，以促进种植物的生长[25]。
1.2.3 动物分组 正常子宫内膜组6只，子宫腺肌症在位内膜组及卵巢巧克力囊肿内壁组织组分别各7只。免疫组化用SP法。
2 结果
2.1 种植病灶发展情况 种植24 d时，各组随机取2只裸鼠，杀死后检查腹腔内病灶种植情况。3组裸鼠体内均未发现明显的肉眼可见的病灶，但肠系膜间均有黏连。留取腹腔内组织常规石蜡包埋，HE染色后病理学检查：卵巢巧克力囊肿内壁组织组的2只裸鼠大网膜上见有子宫内膜的腺体生长，子宫腺肌症在位内膜组的1只裸鼠肠系膜组织中见有子宫内膜腺体生长，另1只及正常子宫内膜组的2只裸鼠体内均未见有子宫内膜腺体生长，但可见炎细胞浸润。
种植40 d时，各组杀死1只检查：3组裸鼠体内均有肉眼可见的结节状物，直径在2～3 mm，2只在网膜上，1只在肠壁上，肠系膜上及网膜上见黏连，局部见组织黄染，腹腔及盆腔未见有液体。镜下检查3只均见子宫内膜腺体生长，在肠壁上生长的腺体有向肌层生长的倾向。
种植50 d时，将余下的裸鼠杀死，卵巢巧克力囊肿内壁组的4只裸鼠体内、子宫腺肌症在位内膜组的4只裸鼠体内及正常子宫内膜组的2只裸鼠(1只裸鼠自然死亡，因组织自溶未取材)体内解剖时均有肉眼可看到的病灶，多数病灶暗黄色或灰白色，位于肠系膜或网膜上，病灶大小在0.2 cm×0.2 cm左右，有病灶的组织局部呈暗黄色，水肿，裸鼠体内均见肠壁间黏连及网膜黏连，均未见明显盆腹腔积液;病理检查提示10只裸鼠体内均可见到子宫内膜腺体生长，腺腔扩张明显，分泌现象较普遍。
2.2 各组之间种植成功情况 各组之间卵巢巧克力囊肿内壁组种植成功率最高为100%，明显高于所有的文献报道，子宫腺肌症在位内膜组的种植成功率又高于正常在位子宫内膜组的种植成功率。见表1。表1 各组种植成功情况
2.3 各组种植成功病灶的病理检查情况 在24 d时种植成功的病灶中发现的子宫内膜腺体较小，腺上皮细胞矮立方形，周围见基质细胞及血管生长，未见有分泌的情况，未见核下空泡;40多天时腺腔扩张明显，腺上皮细胞较前增高，呈高立方形，有假复层现象，分泌现象明显，可见顶浆分泌及核下空泡，腺腔内见有分泌物，分泌后的细胞成为扁平状。基质内及腺上皮周围血管明显。基质细胞内见炎细胞浸润;并可见基质蜕膜样变化;50 d腺腔扩张明显，腺上皮细胞高立方形，有假复层现象，分泌现象明显，可见顶浆分泌及核下空泡，腺腔内见有分泌物，腺腔周围可见明显的较多血管生长，基质水肿、炎细胞侵润、陈旧性出血及钙盐沉积均可见。
2.4 种植灶分布情况 本资料发现20只裸鼠中种植成功16只，在肠壁上见种植灶1只，网膜及肠系膜脂肪组织中见种植病灶15只，子宫及卵巢表面未见明显病灶生长，与人类的好发部位不同。人类好发部位多在子宫、卵巢、子宫直肠窝、盆底等处。
2.5 免疫组化检查 3组种植成功的病灶均行雌激素受体、孕激素受体及血管上皮生长因子(VEGF)的检查。检查提示裸鼠体内种植成功的子宫内膜腺体上皮细胞上及基质细胞上均有雌激素受体表达，腺上皮上稍强，孕激素受体表达较弱或无;VEGF在子宫内膜腺体上皮细胞上及基质细胞上均有明显表达。
3 讨论
为研究子宫内膜异位症的病因、发病机制、发生发展、治疗和预防对策，需建立实验动物模型。子宫内膜异位症动物模型的种类有：自发性子宫内膜异位症动物模型，如恒河猴、南美猕猴、狒狒等;诱发性子宫内膜异位症模型，如猕猴模型、家兔模型、大鼠模型等;移植性子宫内膜异位症模型，如裸鼠模型、SCID小鼠模型等。常用的为大鼠模型和小鼠模型。选择条件以实验的目的和可行性而异。
3.1 裸鼠子宫内膜异位症模型的优缺点 裸鼠是指先天性无胸腺的裸小鼠，具有先天性无胸腺和全身毛发生长发育异常两个主要缺陷特征，是T淋巴细胞功能缺陷动物，细胞免疫力低下，但B细胞功能基本正常，NK细胞活性较高，可克服异种间的免疫排斥反应，接受人类正常和肿瘤组织移植，移植后的组织仍保持原有的组织学的、染色体的以及生物化学的特征，并且对各种药物的敏感性不发生改变[2,3,6]。成功率较高。裸鼠遗传背景明确，体内微生物可控制，模型形状显著且稳定，质量和规格可选择。裸鼠子宫内膜异位症模型，观察周期短，试验结果临床参考意义大。但与其他动物相比，裸鼠存在体积小，抵抗力低下，不能耐受多次手术采血检测的缺点。由于其免疫功能缺陷，不能用来研究子宫内膜异位症病灶引起的机体免疫方面的改变。
3.2 裸鼠子宫内膜异位症模型的建立方法 腹腔注射法：将新鲜的人增生期子宫内膜粗制成小碎片，注入裸鼠腹腔内。20 d后分期分批处死小鼠，辨别种植的子宫内膜组织并切除用于病理分析。本试验三组腹腔种植法的成功率分别是：正常子宫内膜组种植成功率(3/5)为60%;子宫腺肌症在位内膜组(6/7)成功率为85.71%;卵巢巧克力囊肿内壁组种植成功率最高(7/7)为100%。有文献报道腹腔种植法的成功率96.5%～100%[13,5]，种植物保持原组织学的基本特征，它可在小鼠体内存活10周。本试验总的种植成功率84.2%，较文献报道的低，可能与取材后处理时间较长有关。文献报道卵巢巧克力囊肿内壁组种植后异位病灶的病损变化如出血、坏死、钙化、及纤维组织增生可发现，但腺管发现率低[24]，因为卵巢巧克力囊肿内壁找到腺体较少。本试验卵巢巧克力囊肿内壁组取材时找到了生长旺盛的腺体，所以种植成功的病灶内可见生长旺盛的腺体。由此看来取材的好坏对实验的结果有很大的影响。
3. 3 裸鼠子宫内膜异位症模型的实验结果 本实验采用腹腔种植法，将正常子宫内膜、子宫腺肌症患者的内膜及卵巢巧克力囊肿内壁分别注射到裸鼠腹腔内，观察生长情况。卵巢巧克力囊肿内壁组种植成功率最高，子宫腺肌症患者的在位内膜组种植成功率亦较正常子宫内膜组高。本实验在种植24 d时解剖部分小鼠未发现明显病灶，但镜下可见有种植成功的腺体;种植40 d后裸鼠体内肉眼可见病灶，镜下见腺腔扩张明显，腺上皮细胞高立方形，腺腔周围可见明显的较多血管生长，基质水肿、炎细胞侵润、陈旧性出血及钙盐沉积均可见。故认为饲养时间短，病灶小不易观察，取材时易有疏漏，饲养时间够长，种植病灶能够充分生长，易于观察、易于取材镜下组织反应亦明显。
3.4 异位病灶的部位 Nisolle等观察到种植后裸鼠体内黏连多发生在侧腹部和腹部脂肪组织间[6]。本实验中发现种植成功的病灶多在网膜及肠系膜中，肠壁上也可见到，与文献报道的相同。但与人类子宫内膜异位病灶发生部位不同，人类主要在子宫直肠窝、膀胱、卵巢及直肠等盆腔部位，这可能与人取直立姿势、小鼠取俯卧姿势，不同的重力作用有关。
3.5 各组不同的种植率 提示正常子宫内膜、卵巢巧克力囊肿内壁组织及子宫腺肌症在位内膜组织之间有着某些差异。在裸鼠体内不同的种植成功率说明3种不同的种植物对组织的侵袭能力不同。有文献报道[7]异位的内膜中血管生长因子水平高于正常子宫内膜，粘附因子水平亦高于正常，故易于生长。3组种植成功的病灶中免疫组化检查成功种植的病灶腺上皮及基质细胞上均有明显的VEGF 表达，VEGF可促进血管的生长，雌激素受体较孕激素受体表达明显说明异位的内膜对孕激素的作用不明显。有文献报道 免疫组化检查提示VEGF在子宫内膜腺体上皮细胞上及基质细胞上均有明显表达。
理想的动物模型应尽可能与人类疾病生长进程及功能相似，且规范化，能够准确地再现该疾病的特点，反映疾病的发展变化，还应在临床上有实用性和可控性，复制时经济易行。本实验证实裸鼠卵巢巧克力囊肿内壁、子宫腺肌症患者的在位内膜移植成功率高，移植后组织仍保持原有的组织形态及生化特征。相对灵长类动物而言价廉易得，便于管理，为建立以位症模型的理想动物。
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