内容
作者：张艳丽1，范新生2，李澎涛2，顾立刚2
【摘要】 目的 研究毒热平注射液对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响。 方法 用流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1) 感染小鼠，建立小鼠流感病毒性肺炎的生物模型，用不同浓度毒热平注射液治疗后，采用MTT法测定脾脏T细胞增殖能力;ConA诱生IFN-γ并用ELISA方法检测INF-γ含量;中性红比色法测定腹腔巨噬细胞的吞噬能力;用ELISA试剂盒测定肺匀浆中细胞因子IL-4及IL-10的含量。结果 毒热平注射液各剂量组均能明显上调病毒感染组小鼠的T细胞增殖能力、腹腔巨噬细胞的吞噬能力和INF-γ活性(P 0.01);各剂量组显著下调小鼠肺匀浆的IL-4和IL-10的活性。结论 毒热平注射液可通过调节机体的免疫功能发挥抗病毒作用。
【关键词】 毒热平; INF-γ; 流感病毒; 免疫功能
Immunomodulatory effects of Dureping Injection in mice infected by influenza virus
ZHANG Yan-li, et al. (Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)
[Abstract] Objective To investigate the effects of Dureping Injection on immunological function in ICR mice infected by influenza virus. Methods The murine pneumonia model was established induced by influenza virus strain A/ FM/ 1/ 47 (H1N1), treated with different dose group of Dureping Injection. The proliferous ability of T lymphocytes in spleen was detected by MTT assay, the phagocytic function of murinal celiac macrophage (Ana-1) was detected by Neutral Red Colorimetry, the bioactivity of interferon-γ (IFN-γ), interleuking-1 (IL-4) and interleuking-10 (IL-10) in the murine lung was measured by ELISA. Results Different dose group of Dureping Injection up-regulated the proliferation of T lymphocytes, phagocyte ability of murinal celiac macrophage and bioactivity of IFN-γ; down-regulated the bioactivity of IL-4 and IL-10. Conclusion Dureping Injection has obvious antiviral effects by regulating the immunological function.
[Key words] Dureping; INF-γ; Influenza virus; Immunomodulatory function
甲型流行性感冒病毒感染是威胁全球公共卫生安全的主要病因之一，在老人、儿童和免疫缺陷人群中有很高的发病率和死亡率[1]，尤其是2009年发生的甲型H1N1流感再次引起全球的关注[2,3]，抗流感病毒的研究工作变得日益紧迫。中草药在抗病毒方面具独特的优势，毒热平注射液是由黄芩、栀子、灯盏花和猪胆粉四味药物制成的中药复方注射剂，具有清热解毒、凉血通络之功效。本研究通过建立流感病毒感染的生物模型，观察药物对免疫系统功能的影响，探讨毒热平注射液发挥抗病毒作用的机制。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重(14±1)g，合格证号：SLXK(京2005-2006)，级别：SPF/VAF。小鼠及饲料均由北京维通利华实验中心提供。饲养环境：本室动物室动物洁净柜，室温：(22±2)℃，相对湿度：(50±10)%。
1.1.2 病毒：流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)，中国中医药研究院中医所提供，本实验室–76℃保存备用。于9日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次后，测血凝滴度为210。
1.1.3 药物 ：毒热平注射液，由黄芩、栀子、灯盏花和猪胆粉四味药物制成的中药复方注射剂，棕色液体，含生药17.4 g/L，由广东康美药业有限公司开发提供;阳性对照药：注射用双黄连(冻干粉)：0.6 g干粉/支，实验前用无血清DMEM培养液配制成40 g/L备用，批号：0501004(哈药集团中药二厂);利巴韦林：0.1 g/ml，批号：0506251(石药集团欧意药业有限公司)。
1.1.4 试剂 ：乙醚、生理盐水、ConA、MTT、0.075%中性红溶液、Tris-NH4Cl、RPMI1640、小牛血清、PBS、肝素、巨噬细胞溶解液(50%无水乙醇+50%0.1M醋酸，4℃存放)等由本实验室提供。细胞因子检测试剂盒购自美国Biosource公司。
1.2 方法
1.2.1 流感病毒对小鼠半数致死量(LD50)的测定：取ICR小鼠50 只，用单纯随机抽样法平均分成5组，病毒为2-6-2-10 5个稀释度，每只小鼠经乙醚轻度麻醉后分别滴鼻感染不同稀释度病毒液0.05 ml，以死亡和生存为观察指标，24 h 内死亡的小鼠不予统计。每天观察记录，直至感染后第14 d为止。按Reed-Muench 公式计算出病毒的 LD50。
1.2.2 造模及给药方式：取ICR小鼠70只，随机分组、给药见表1。将各组小鼠用乙醚轻度麻醉，正常对照组以生理盐水0.05 ml 滴鼻，其余各组以40 LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0.05 ml，于感染后第2d开始腹腔给药，对照组在同等条件下注射生理盐水，每天一次连续6 d，第7d摘眼球放血处死。然后根据不同检测指标采集标本。表1 动物分组和毒热平注射液腹腔给药剂量
1.2.3 脾脏T细胞增殖能力的测定(MTT法):无菌摘取脾脏(每组5只)，常规制备脾细胞悬液(冰浴)，加入15 ml Tris-NH4Cl，置室温10 min。用无血清的RPMI 1640培养液清洗脾细胞2遍(4℃，1500 r/ min，离心10 min)，用完全RPMI 1640培养液调节细胞浓度至5×106/ml，加至96孔板中，100 μl/孔。分别加入含ConA的完全RPMI1640培养液100 μl /孔(ConA终浓度为5 μg/ml)，置37℃ 5%CO2培养箱孵育68 h，取出，各孔吸出100 μl上清，加入MTT 10μl /孔(终浓度0.5 mg/ml)，继续孵育4 h，加入0.01N HCl-10%SDS 100 μl/孔，振荡4℃过夜，次日于酶标仪570nm处测定各孔A值。
1.2.4 INF-γ的诱生及活性检测: 无菌摘取脾脏(每组5只)，常规制备脾细胞悬液，用完全RPMI1640培养液调节细胞浓度至5×106/ml，加入24孔板中，1ml/孔，加入ConA使终浓度为5 μg/ml，置37℃ 5%CO2培养箱孵育72 h取出，吸出上清，4℃，3000 r/ min 离心10min，吸取上清即得INF-γ粗制品，分装于effendoff管中，-76℃保存。严格按ELISA试剂盒说明程序检测INF-γ含量。
1.2.5 腹腔巨噬细胞吞噬能力的测定(中性红比色法):实验小鼠摘眼球放血处死后，以含肝素的冷PBS灌洗腹腔，每只吸取腹腔液约6 ml，PBS清洗细胞2次，用完全RPMI 1640培养液调节细胞浓度至4×106/ml，加至96孔板中，100 μl /孔，37℃，5%CO2培养箱中孵育4 h，弃上清，加入0.075%中性红溶液200 μl /孔，30 min后以温PBS洗涤2次，加入巨噬细胞溶解液200 μl /孔，4℃过夜，次日于酶标仪530 nm处测定各孔A值。
1.2.6 肺匀浆中IL-4、IL-10的含量测定(ELISA法):无菌摘取肺脏，在低温条件下，按常规方法制作肺组织匀浆[肺重(g) / 生理盐水(ml) = 1/ 9)]，4 ℃，3000 r /min离心30 min后取上清，置-20℃ 冰箱中存放，待测肺组织中IL-4和IL-10的表达。采用双抗体夹心ABC-ELISA 法检测，程序按照试剂盒说明书进行。
1.3 数据处理: 数据用SPSS12.0软件进行处理，计量资料的组间显著性比较用t检验，P 0.05 为有统计学意义。
2 结果
2.1 流感病毒感染小鼠的LD50：按Reed-Munch 公式计算出病毒的 LD50 为10-2.2。
2.2 毒热平注射液对FM1感染小鼠免疫功能的影响：见表2。
3 讨论
流感病毒常引起下呼吸道感染而致肺损伤，多属于中医的风温肺热病。传统认为病初邪在卫分，继而由卫及气，表现为肺热壅盛的气分证候，多以清热解毒药治疗。近年来认为该类疾病气分热盛的同时伴有明显的血分证候，出现肺络受损的病理变化，即“毒损肺络”是其深层病机。毒热平注射液是由黄芩、栀子、灯盏花和猪胆粉四味药物制成的中药复方注射剂，是根据长期临床实践基础上形成的中医理论“毒损肺络”的病机理论，结合现代医学有关下呼吸道感染性疾病的病理过程及治疗的研究成果，针对感染性疾病的中心环节-炎症反应，配伍研制而成。流感病毒常引起下呼吸道感染而致肺损伤，全方解毒与通络并举，解毒以去除络损的病理因素，利于络脉功能恢复;通络给邪以出路，使毒邪易祛，二者相辅相成，相得益彰，共奏清热凉血、解毒通络之功效。
流感病毒感染后引起机体的免疫应答，包括固有免疫和适应性免疫[4、5]，能控制和消除病毒感染。流感病毒经呼吸道黏膜上皮细胞侵袭机体，并在机体内增殖，导致呼吸道各类细胞变性、坏死，病毒颗粒还能穿过呼吸道黏膜，引起进行性感染，导致淋巴细胞、单核及多核细胞生长特性改变、功能降低甚至表2 毒热平注射液对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响注：与正常对照组比较：△P 0.001;与病毒对照组比较：^P 0.05，^^P 0.01，^^^P 0.001溶解、凋亡，使机体免疫功能降低[6、7]。本实验结果发现，FM1感染模型组小鼠脾脏T细胞的增殖能力、T细胞产生INF-γ的能力、腹腔巨噬细胞吞噬功能显著降低，可能与FM1感染导致小鼠免疫功能抑制有关。毒热平注射液各治疗组对其均有明显的上调作用，与模型组相比较差异有统计学意义，说明毒热平注射液能促进FM1感染小鼠固有免疫和适应性免疫功能，增强机体抗病毒能力。
大量实验发现，许多微生物感染如鼠流感病毒、麻疹病毒、鼠呼吸道合胞病毒、鼠单纯疱疹病毒、鼠肝炎病毒等感染均有Th1/Th2 漂移的情况存在，机体抗病毒感染应以Th1 介导的细胞免疫为主，一旦发生Th2 漂移，预后较差[8]。INF-γ 由Th1 细胞分泌，主要介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应性炎症的形成。 IL-4、IL-10 由Th2 细胞分泌，能够抑制Th0 细胞向Th1 细胞转化，IL-4 对Th0分化起关键性的调节。本实验结果发现，FM1感染小鼠模型组T细胞诱生的INF-γ显著下降，而肺匀浆中IL-4、IL-10显著上升，表明流感病毒感染后Th1细胞向Th2细胞显著移行， Th1/Th2细胞平衡破坏，导致FM1感染小鼠肺组织炎性损伤加重。毒热平各用药组对FM1感染小鼠具有明显的治疗作用，不仅能显著上调感染小鼠INF-γ的产生，同时还能显著降低肺匀浆中IL-4、IL-10的含量，提示毒热平注射液可能通过直接或间接对Th1、Th2平衡进行调节，使这种失衡得以逆转，从而增强机体的抗病毒能力。
本研究证实毒热平注射液可通过调节机体的免疫功能发挥抗病毒作用。究其发挥抗病毒作用的分子机制本实验室正在研究，继后报道。
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