内容
作者：高 飞1,姜 宁2,郑景存2,王国增2,贺 伟2,张璞暹1 张 鹤
【摘要】 目的 探讨线粒体途径在高草酸尿大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用。方法 雄性成年SD大鼠24 只，随机分为4 组，每组6只，设为正常组、高草酸尿组、环孢素A(CsA)对照组、CsA干预组。各组均在第4 周末处死并取左肾,常规HE染色检测肾小管草酸盐结晶沉着情况;原位末端标记法( TUNEL) 检测肾小管上皮细胞凋亡程度;免疫组化检测细胞色素c(Cyto C )、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达。结果 高草酸尿组和CsA干预组肾小管腔内可见明显晶体沉着，正常组和环孢素对照组未见晶体沉着;与其它3组比较，高草酸尿组凋亡指数显著增高、Cyto C、 Caspase-3和Caspase-9表达明显增强(P 0.01)。结论 线粒体途径参与了高草酸尿大鼠肾小管上皮细胞凋亡，CsA具有降低凋亡指数及抑制Cyto C、 Caspase-3和caspase-9蛋白表达的作用。
【关键词】 高草酸尿;大鼠;线粒体途径;凋亡;免疫组化
Role of mitochondrial pathway in the development of renal tubular epithelial cell
apoptosis in the rats with hyperoxaluria
GAO Fei, et al. (Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital, Shanghai Pudong 200135, China)
[Abstract] Objective To investigate the role of mitochondrial pathway in the development of renal tubular epithelial cell apoptosis in the rats with hyperoxaluria. Methods Twenty four male Wistar rats were randomly divided into four groups (n=6): Control Group, Hyperoxaluric Group, Interventional Control Group and Ciclosporin A Group. The rats were sacrificed in 4 weeks after left ephrectomy was then performed. The tissue sections obtained from kidneys that were examined under light microscopy for presences and degrees of Oxalate crystal depositions in the tubular Lumina. Apoptotic changes in renal tubular cells were examined using the terminal deoxynucleotidyl transferase ( TdT)-mediated dUTP in situ nick and labeling ( TUNEL) method. Expressions of Cytochrome C (Cyto C), Caspase-3 and Caspase-9 were examined by the method of the immunohistochemistry. Results Oxalate crystal depositions were evident in the renal tubular lumen in the Hyperoxaluric Group and the Ciclosporin A Group, while there was no evidence in Control Group and the Interventional Control Group. Compared with other 3 groups, apoptotic index (AI) in the Hyperoxaluric Group was increased obviously. Conclusion The mitochondrial pathway plays an important role in the apoptosis of the renal tubular epithelial cell of the rate with hyperoxaluria. Ciclosporin A can relieve the apoptosis and the expressions of the Cyto C, Caspase-3 and Caspase-9.
[Key words] Hyperoxaluria; Rat; Mitochondrial pathway; Apoptosis; Immunohistochemistry
肾结石是最常见的泌尿系疾病之一，其中草酸盐结石占70%-80%，但形成机制尚不完全清楚。近年研究表明高草酸尿造成的肾小管上皮细胞损伤，是引起泌尿系结石的重要原因。我们通过建立高草酸尿大鼠模型，对高草酸尿导致大鼠肾结石形成中的机理进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 药品与主要试剂：环孢素A软胶囊(CsA)50mg/粒，批号：H20040531，生产厂： R.P.Scherer GmbH Co. KG。兔抗大鼠多克隆抗体Cyto C、Caspase-3、Caspase-9;二氨基联苯胺(DAB)显色液;原位末端标记法( TUNEL)凋亡试剂盒(武汉博士德)。即用型非生物素免疫组化EliVisionTMplus检测试剂盒(福建迈新)。
1.2 动物分组、给药方法及标本处理：宁夏医科大学实验动物中心提供的清洁级成年雄性SD大鼠24只，体重(182±14)g，随机分为4组,每组6只，相同环境下适应性喂养1周，随后按下列方法处理4 周：正常对照组：于第2周给生理盐水2ml/(kg·d)灌胃;高草酸尿组：于第1周起饮用0.75%乙二醇;CsA对照组：于第2周给CsA 8mg/(kg·d)灌胃;CsA干预：第1周起饮用0.7%乙二醇，第2周起CsA 8mg/(kg·d)灌胃。第4周末取左肾标本。采用6.5 %水合氯醛(0.5 mg/ 100g) 腹腔注射麻醉，取左肾，剪成4 mm ×5 mm 组织块，置入4 %多聚甲醛固定过夜。
1.3 检测指标和方法：切片常规HE 染色，偏光显微镜下观察晶体沉着情况，200倍视野下计数肾小管腔内晶体沉着，按文献标准分级：0级—无任何结晶亮点;Ⅰ级—细小的结晶亮点广泛但不成堆;Ⅱ级—结晶变粗大、成堆，但散在不连接;Ⅲ级—成堆结晶局部互相连接;Ⅳ级—广泛成堆结晶,连接成片。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法对肾组织切片进行免疫组化染色，按试剂盒说明书步骤进行检测，光镜下观察,蓝棕色核为凋亡细胞，随机选择5 个高倍视野，计数凋亡细胞及细胞总数目，计算凋亡指数(apoptic index ,AI) 。
免疫组化(二步法) 检测胞浆Cyto C 、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达，步骤按照试剂盒说明进行，应用Image pro plus 6.0 图像分析软件进行图像分析，每张切片随机选取5 个具有代表性的高倍视野，通过软件自动得出阳性染色的积分光密度值(IOD)平均后代表这个标本的染色强度。
1.4 统计学处理：计量资料以(±s)表示，所有数据应用SPSS 11. 5 软件进行分析，均数的比较采用单因素方差分析，结晶评分比较用秩和检验。
2 结果
2.1 肾组织病理学检查及偏光显微镜检查：标本肉眼观：正常组、CsA对照组和CsA干预组大鼠肾脏形态正常;高草酸尿组肾脏均明显肿大，切面苍白色，见细小白色颗粒，用手触摸有轻度的细砂摩擦感，皮质和髓质分界不清楚。偏光显微镜下观察：正常组和CsA对照组肾实质内未见晶体沉着;高草酸尿组晶体沉着Ⅱ级2例，Ⅲ级1例，Ⅳ级3例，与其他3组相比差异均有统计学意义( P 0. 01) ;CsA干预组0级3例，Ⅰ级2例，Ⅱ级1例，结晶沉积情况居于高草酸尿组( P 0. 01)和正常组、CsA对照组之间( P 0. 05)，晶体主要存在于远曲小管和集合管。
2.2 TUNEL检测结果：TUNEL阳性细胞位于肾小管上皮细胞,尤其是远曲小管;各组凋亡指数见表1。
2.3 Cyto C 、Caspase-3和Caspase-9的阳性表达：Cyto C阳性细胞表现为细胞质呈棕黄色，细胞核无着色，阳性表达位于肾小管上皮细胞，肾小球未见表达(图1);Caspase-3阳性细胞表现为细胞质和部分细胞核呈棕黄色，肾小管上皮细胞以远曲小管上皮细胞阳性表达明显，肾小球未见表达(图2);Caspase-9阳性细胞表现为细胞质呈棕黄色，细胞核无着色，阳性表达位于肾小球和肾小管上皮细胞以远曲小管上皮细胞明显(图3)。图像分析结果见表1。 表1 实验各组Cyto C 、Caspase-3和Caspase-9 IOD值及凋亡指数
3 讨论
已知草酸盐引发的肾小管上皮细胞损伤在尿路结石形成中起关键作用。线粒体不仅是细胞内能量代谢的中心，也是细胞凋亡网络的中心环节[1]。国外等[2-4]进行的研究发现肾小管上皮细胞凋亡与肾结石的形成密切相关，其中线粒体功能障碍占尤为重要的地位[5]。本研究发现高草酸组大鼠肾小管上皮凋亡指数明显高于正常组，提示高草酸尿可以诱导大鼠肾小管上皮细胞的凋亡，细胞凋亡脱落后基底膜暴露、磷脂酰丝氨酸、外翻、膜对称性丧失等促进草酸盐晶体附着[6]，晶体及凋亡坏死、脱离的肾小管上皮细胞通过异质性成核机制形成肾结石。同时高草酸尿组大鼠肾小管上皮细胞胞浆中Cyto C、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达明显高于正常组，提示持续性高浓度的草酸尿引起的细胞损伤可能通过激活细胞脂质信号途径，产生脂质信号分子损伤线粒体使活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生增加，线粒体跨膜电位(Δψm)丧失[7]，使线粒体膜间隙内Cyto C释放，激活Caspase-9、Caspase-3，促使肾小管上皮细胞凋亡。
细胞色素C 从线粒体释放到胞浆在线粒体途径凋亡中发挥着重要作用[8]。细胞色素C释放与线粒体膜通透性转运孔(mPTP) 的开放有关，mPTP是由电压依赖性阴离子(VDAC ) 、腺苷酸移位酶(ANT) 及亲环素D 复合物(cyclop hilin D)在线粒体内、外膜交接处构成的一种孔道复合物，释放的细胞色素C在ATP或dATP的参与下，与Apaf-1及Caspase-9共同组成apoptosome;激活的Caspase-9，再活化Caspase-3, 最终导致细胞凋亡[8] 。CsA是目前发现mPTP的强有力的抑制剂之一[9]，可通过特异性的与Cyclop hilin D结合,来抑制mPTP的开放，可抑制细胞色素C的释放、阻断线粒体途径诱导的细胞凋亡。本研究发现同时应用CsA的干预组细胞凋亡指数及晶体沉着程度明显低于高草酸尿组，但仍显著高于正常组和CsA对照组，提示CsA可能通过抑制mPTP的开放减少了高草酸尿导致的肾小管上皮细胞的凋亡，从而起到预防肾结石形成的作用。
【参考文献】
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