内容
作者：赵今 哈木拉提·吾甫尔 李艳， 孙玉亮， 牛巧丽 作者单位：1新疆医科大学第一附属医院口腔科, 2新疆医科大学, 新疆 乌鲁木齐
【摘要】 目的: 了解实验药物没食子鞣质及有效提取物对口腔细菌生物膜整体生物量的影响。方法：将附着于材料表面的细菌生物膜作为一个整体，运用半定量可见光测定OD值的方法，研究和评估实验药物没食子鞣质及有效提取物对口腔细菌生物膜生物密度的影响。结果：口腔细菌生物膜生长在体外表现出缓慢的非线性生长趋势，48～72 h出现一个较为稳定的平台期。没食子鞣质及有效提取物对细菌生物膜都有一定的浓度依赖性，其作用随着药物浓度提高而明显，药物对12 h细菌生物膜的影响最有效，对48 h成熟生物膜作用最小。结论：没食子鞣质及有效提取物能够减低口腔细菌生物膜在材料表面的整体生物量。
【关键词】 没食子; 细菌生物膜; 生物膜生物密度
The inhibition effects of Turkish gall on the biomass of oral bacteria biofilm
ZHAO Jin， Hamurat·Wupur， LI Yan， et al
(Department of Stomatology, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,
Urumqi 830011, China)
Abstract: Objective： To investigate the inhibition effects of Turkish gall on the biomass of oral bacteria biofilm. Methods: The visible light semiquantitative method has been used to measure biomass (OD570) values so that the effect of Turkish gall 1 and Turkish gall 2 on biomass of oral bacteria biofilm had been discovered. Results: The inhibition effects of Turkish gall 1 and Turkish gall 2 on biomass were discovered effective at 24 h bacterial biofilm, but they were concentration dependent. In the same concentration, susceptibility to medicine of development biofilm was lower than that of developing biofilm. Conclusion: Turkish gall 1 and Turkish gall 2 had an inhibitory effect on the biomass of oral bacteria biofilm.
Key words: Turkish gall; cariogenic bacteria; adherence
细菌致龋的首要条件是定植于牙面形成牙菌斑。在定植过程中，牙菌斑内部形成生化梯度，使得多种细菌协调共生形成细菌群，这种生长形式叫做生物膜[1-2]。所以，牙菌斑是一种具有复杂细菌群结构的口腔生物膜。细菌一旦形成生物膜后，各微生物相互依存，相互竞争，构成了复杂的生态关系。研究表明生物膜中细菌细胞的抗药性及各种生化代谢效率均显著高于体外培养游离细胞[2-3]。目前药物的研制开发以浮游细菌为研究对象，因此用于控制浮游细菌感染的策略对生物膜并不十分有效，往往对浮游菌非常有效的药物浓度却很难清除生物膜感染。口腔致龋菌是以生物膜状态存在的，因此研究开发抗生物膜作用的有效药物是清除生物膜的措施。细菌生物膜定量研究有半定量和定量2种方法，半定量研究方法是将附着于材料表面的细菌生物膜作为一个整体进行测量，可见光及普通的荧光测量法即属此类方法。本研究采用半定量可见光测定没食子鞣质及有效提取物对口腔细菌生物膜总体密度OD值，目的主要是了解实验药物对口腔细菌生物膜整体生物量的影响。
1 材料与方法
1.1 实验菌株 变形链球菌 Streptococcus mutans ATCC 25175，血链球菌 Streptococcus sanguis ATCC 10556，粘性放线菌 Actinomyces viscosus ATCC 19246，乳酸杆菌 Lactobacillus rhamnosus AC 413，实验菌株由口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。
1.2 菌悬液制备 将复苏48 h后的各株细菌分别接种于BHI液体培养基中，在80% N2、20% CO2、37℃条件下厌氧培养18～24 h，涂片检查为纯培养后，使用Crystal SpecTM比浊仪测取菌悬液浓度，用BHI将菌悬液浓度调至1.0 McFarland(3×108 CFU/ml)备用。
1.3 实验药物药液的制备 没食子鞣质及没食子提取物2，先用蒸馏水将药物配制成128.000 mg/ml的母药液放置冰箱(4℃)备用。使用时将母药液按2倍稀释法溶于BHI液体培养基中形成BHI药液培养基，使其最终浓度达到32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000 mg/ml。
1.4 实验主要试剂设备 YZ1515型单通道蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)， pH控制仪(Jenco，上海任氏电子有限公司)，HX-1050型循环水浴箱(北京博医康技术公司)，培养罐(continuous culture vessel，四川大学玻璃仪器制造厂)，CJJ-781型磁力加热搅拌器(江苏金坛振兴仪器厂)，恒温培养箱(上海浦东跃欣科学仪器厂)，标准96孔微量板(Corning Incorporated CostorR 3599 )，CrystalTM SpecTM比浊仪(美国 Becton Dickinson and Company)，八通道排枪(TransferpetterR-8 30-300 μl，BRAND 德国)，HTS 7000 PLUS型多孔板(荧光/紫外光)高效分析仪(美国PERKIN ELMER);MBECTM-Device(MBEC Biofilm Technology Ltd., Calgary Alberta, Canada. U.S Patent)，1% Crystal Violet(wt/vol)(Sigma Chemical Company)。
1.5 混合菌悬液的形成
体外4种实验菌株培养及鉴定
4种实验菌菌悬液的配制(1.0 McFarland)
BHI培养基，粘性放线菌和乳杆菌的菌悬液加入
发酵罐中连续培养2 d
加入变形链球菌和血链球菌的菌悬液
培养2～3 d 发酵罐中的混合菌培养达到稳定之后
用蠕动泵将混合菌悬液泵出
比浊调整菌悬液浓度为1.0 McFarland使用
1.6 生物膜生长曲线测定 菌悬液50 μl加BHI培养基150 μl加入MBECTM-Device 96孔微量板(总体积200 μl/孔)。分别在6、12、24、36、48、60 h和72 h加入培养基和菌悬液，在80% N2、20% CO2 、37℃条件下厌氧培养形成不同时段生物膜，实验过程中每12小时更换新鲜培养基150 μl/孔，每时段12个平行孔，重复3次实验，以不含菌悬液的孔作为基数对照。孔微量板取出后，在装有PBS标准96孔板内清洗樁钉2～3次去除浮游细菌，在室温下干燥30 min，盖板放入装有0.1% Crystal Violet(wt/vol)200 μl/孔的96孔板内20 min染色， 同样方法清洗2~3次樁钉，室温下干燥30 min ，盖板放入装有95%乙醇200 μl/孔新的96孔板内，微量震荡器上震荡30 min 复吸染液，HTS 7000 PLUS型多孔板(荧光/紫外光)高效分析仪测定OD570，记录各时间段细菌生物膜的形成情况并绘制生长曲线。
1.7 药物对细菌生物膜总密度的影响 菌悬液50 μl加BHI培养基150 μl加入MBECTM-Device 96孔微量板(总体积200 μl/孔)。分别在3块孔板内在80% N2、20% CO2、37℃下厌氧培养形成12、24、48 h 3个不同时段细菌生物膜(每12小时更换150 μl/孔BHI培养基)，在装有PBS标准96孔板内清洗樁钉2~3次去除浮游细菌，放入内有终浓度为32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000 μl/ml的实验药物的BHI药液培养基的96孔板内，80% N2、20% CO2、37℃下厌氧培养24 h，同样方法清洗2~3次樁钉，室温下干燥30 min ，盖板放入装有95%乙醇200 μl/孔新的96孔板内，微量震荡器上震荡30 min 复吸染液，HTS 7000 PLUS型多孔板(荧光/紫外光)高效分析仪测定0D570。
1.8 实验分组 阴性对照组： 没有药物作用的细菌生物膜组，12个平行孔;阳性对照组：0.05%洗必泰作用的细菌生物膜组，12个平行孔;实验组：实验药液作用细菌生物膜组，每个药物浓度4个平行孔，实验重复3次。
1.9 统计学处理 实验数据采用SPSS 10.0 统计软件分析，各实验组与阴性对照组间的比较选用单因素方差分析的Dunnet t双侧检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 体外口腔混合细菌生物膜生长曲线 体外口腔混合细菌生物膜生长曲线测定发现口腔细菌生物膜生长表现出缓慢的非线性生长趋势，48 ～72 h出现一个较为稳定的平台期，从生长曲线可以看出细菌形成生物膜的3个时期,即早期(12 h)、形成期(24 h)和成熟期(48 h)(图1)。
2.2 实验药物对细菌生物膜总密度的影响 没食子鞣质及有效提取物2对细菌生物膜都有一定的浓度依赖性，作用随着药物浓度提高而明显，药物对12 h细菌生物膜的影响最有效，对48 h成熟生物膜作用最小(图2～6)。
3 讨论
用药物来控制和清除细菌生物膜时发现实验室测定敏感性很好的药物在预防和治疗过程中没有达到预期的效果，主要原因是在药物敏感性测定时用的是浮游状态细菌而不是生物膜细菌。口腔中牙菌斑生物膜是由多种微生物在牙面上沉积的有机基质中互相集聚、交联而形成的生态结构，生物膜中各种微生物相互依存，相互竞争，构成了复杂的生态关系。生物膜结构和功能的构建、个体细菌表型的适应影响了细菌代谢过程，降低了细菌对药物的敏感性[4-5]。尽管抗菌因子抗龋的最初研究都开始于对游离状态致龋细菌抗菌活性的研究，但对防龋药物性能的最终评价应从多方面综合考虑。
研究细菌生物膜的方法有两大类，即定性研究和定量研究。定性研究主要目的在于了解细菌生物膜形成的过程及生物膜形态，主要依靠几种不同的显微镜作为研究仪器，常用用于观测细菌生物膜的有透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、 干涉对比显微镜(DIC)、原子显微镜(AFM)、荧光显微镜(FLUM)以及激光共聚焦扫描电镜(SCLM)等，这些仪器和方法各有其应用的领域[6]，没有一种方法可以反映细菌生物膜的所有信息。定量研究又有半定量和定量之分。国外还有使用核磁共振作为半定量研究的，但主要适用于多孔材料表面，如羟基磷灰石等[7]。定量研究中使用最广泛的是激光共聚焦扫描电镜(SCLM)。国外也比较多的使用原子显微镜(AFM)，但这种方法对材料的要求很高，使用上存在一定的困难。
本实验研究药物对细菌生物膜总体密度影响的目的主要是了解实验药物对口腔细菌生物膜整体生物量的影响，因此选择半定量的570 nm可见光测定。通过用0.1%Crystal violet染色细菌生物膜，95%乙醇复吸染料，根据光线传播的原理，传播介质中的非透光颗粒可将投射于其上的光线散射。因此，光线阻射值与传播介质中非透光颗粒的数量(即混浊度)成正比。根据这一原理，实验中所得的OD值与形成的细菌生物膜的生物密度量成正比。在体外MBECTM-Device中根据各时间段的测定结果绘制的生长曲线，可以发现口腔细菌生物膜生长表现出缓慢的非线性生长趋势，在48～72 h出现一个较为稳定的平台期，这一点与浮游菌呈指数生长繁殖的现象完全不同[8]。说明口腔细菌生物膜在48 h生长达到了成熟期。从生长曲线也可以看出口腔细菌形成生物膜的3个时期，即早期(12 h)、形成期(24 h)和成熟期(48 h)。从不同药物浓度对口腔细菌生物膜生物密度的影响结果可以看出实验药物对口腔细菌生物膜都有一定的浓度依赖性，随着药物浓度提高，作用就越明显。而且药物对12 h生物膜的影响最有效，对48 h成熟生物膜作用最小。细菌生物膜不同于浮游菌的一大特点即表现在生长繁殖速度与时间的关系上。浮游菌的繁殖完全呈指数模式。但细菌生物膜的形成有些类似线性关系，但不是标准的线性模型，体外实验测得的白色念珠菌生物膜是呈线性生长的。浮游菌繁殖到一定阶段，细菌总数不再增加，繁殖速度与死亡速度近乎相等。不同细菌这一稳定期出现的时间不同，但大多是在10～14 h 。细菌生物膜的形成虽然缓慢，但直到72 h过后仍没有生长停止的趋势。 尽管Sutherland[9]认为48～72 h细菌生物膜已经成熟，但看来这样的成熟并不意味着生长停止，随着环境中的营养被消耗，越来越多的细菌必须加入生物膜才能继续生存，运用CSLM对绿脓杆菌生物膜进行研究的结果发现，72 h后生物膜厚度稳定在(42±28) μm，但生物膜内细菌仍在进一步聚集，水通道的数量也在增加。
关于药物对生物膜作用的研究还需要从对生物膜的形成、生物膜细菌组成和代谢、生物膜形态结构、生物膜的胞外基质的影响等方面进行深入研究，这样才能从本质上阐明药物对生物膜的作用机制。
【参考文献】
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