内容
作者：赵今 李 艳， 孙玉亮， 牛巧丽， 哈木拉提·吾甫尔 作者单位：1新疆医科大学第一附属医院口腔科, 2新疆医科大学, 新疆 乌鲁木齐
【摘要】 目的: 研究天然药物没食子鞣质及有效提取物对变形链球菌和粘性放线菌在唾液获得性膜粘附的影响。方法：采用唾液包被的羟磷灰石(SHA)形成体外实验性膜，用没食子鞣质及有效提取物处理变形链球菌和粘性放线菌，观察实验药物对实验细菌在唾液获得性膜上粘附的影响。结果：没食子鞣质及有效提取物处理变形链球菌可明显抑制其在SHA上的粘附，其中没食子鞣质的抑制作用较提取物2显著。没食子鞣质及有效提取物处理粘性放线菌不能有效抑制菌细胞对SHA的粘附。结论：没食子鞣质及有效提取物对口腔致龋细菌粘附抑制作用有一定的选择性。
【关键词】 没食子; 致龋细菌; 唾液获得性膜; 粘附
Actinomyces viscosus to salivary acquired pellicle ZHAO Jin， LI Yan， SUN Yu-liang， et al
(Department of Stomatology, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,
Urumqi 830011, China) Abstract: Objective： To investigate the effects of Turkish gall 1 and Turkish gall 2 on the adherence of Streptococcus mutans and Actinomyces viscosus to salivary acquired pellicle. Methods： The in vitro model of experimental pellicle was saliva coated hydroxyapatites(SHA). Streptococcus mutans and Actinomyces viscosus were treated with Turkish gall 1 and Turkish gall 2 respectively, and then the adherence of bacteria to SHA was tested. Results: Turkish gall 1，Turkish gall 2 could decrease the attachment of Streptococcus mutants to SHA, and the Turkish gall 1 was more effective than the Turkish gall 2. But Turkish gall 1， Turkish gall 2 could not decrease the attachment of Actinomyces viscosus to SHA. Conclusion: It is selectivity that Turkish gall could decrease the attachment of oral bacteria.
Key words: Turkish gall; cariogenic bacteria; adherence 细菌致龋的首要条件是定植于牙面形成牙菌斑,口腔细菌对牙面的粘附是牙菌斑形成的前提。细菌粘附是一个涉及多种机制的复杂过程，其中细菌表面特征与粘附有直接关系，细菌对牙面的特异性粘附可分为蔗糖依赖性和蔗糖非依赖性粘附，前者与细菌合成胞外多糖的能力有关，而后者则是细菌表面的粘结素与牙面唾液获得性膜中受体成分的特异性结合。已有很多研究探讨了变形链球菌和粘性放线菌的粘结素及其受体成分，证明这两种细菌对唾液包被的羟磷灰石(SHA)有很强的粘附能力[1-2]。本实验选择变形链球菌和粘性放线菌作为实验菌株，研究实验药物对实验细菌在唾液获得性膜上粘附的影响。
1 材料与方法
1.1 实验菌株 变形链球菌 Streptococcus mutans ATCC 25175，粘性放线菌 Actinomyces viscosus ATCC 19246，实验菌株由口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。
1.2 主要试剂 同位素3H-胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR，中国科学院上海原子核研究所)，羟磷灰石晶体(HA，BDH Chemical Ltd, Poole, England)，牛血清白蛋白 (BSA，BM)，闪烁液(四川大学华西基础医学院同位素室)，KCl缓冲液。
1.3 试剂配制 没食子鞣质及没食子提取物2溶于KCl缓冲液中, 配成浓度分别为0.250、0.500、1.000、2.000 mg/ml的溶液备用。准确称量羟磷灰石4.0 mg，以200 μl KCl缓冲液浸泡过夜备用。由一健康成人,进食2 h后,清水漱口,不加任何刺激收集唾液,置于离心管中,10 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液备用。
1.4 菌悬液制备 将复苏48 h后的细菌接种于4 ml含370 kBq/ml 3H-TdR的 BHI培养基中，在80% N2、20% CO2、37℃条件下厌氧培养18 h。 涂片检查为纯培养后，将菌悬液转入离心管，室温下2 500 r/m离心15 min，收集细菌。用KCl缓冲液洗菌2次，悬浮于含5 mg/ml BSA 的KCl缓冲液中。调整菌液浓度为：变形链球菌A550nm=0.26，粘性放线菌A540nm=0.20。
1.5 不同浓度药物处理细菌对其在SHA上粘附的影响 没食子鞣质及有效提取物的粘附抑制实验均分为6组，即阳性对照组、阴性对照组及含药物浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml的实验组，每组3个平行。实验流程如下：
阴性对照组和阳性对照组实验组
150 μl菌液+150 μl KCl缓冲液150 μl菌液+150 μl药物溶液
室温下旋转(6 r/min,1 h)
KCl 缓冲液洗涤2次
新配制菌悬液
阴性对照组阳性对照组和实验组
4 mgHA+100 μl KCl缓冲液4 mgHA+100 μl唾液
室温下旋转(6 r/min,1 h)
KCl缓冲液洗涤2次
100 μl BSA溶液
室温下旋转(6 r/min,0.5 h)
KCl缓冲液洗涤2次
100 μl新配菌液
室温下旋转(6 r/min,1.5 h)
KCl缓冲液洗涤3～4次
液体闪烁计数测量(CPM)1.6 粘附抑制率的计算统计分析
粘附抑制率的计算公式：
粘附抑制率=(1-实验组CP-阴性对照组CPM 阳性对照组CPM-阴性对照组CPM)×100%
注：当实验组CPM小于阴性对照组CPM时，令粘附抑制率为100%。 1.7 统计学处理 实验数据采用SPSS 10.0 统计软件分析，各实验组与对照组之间的比较选用单因素方差分析的Dunnet t双侧检验，检验水准α=0.05。
2 结果
没食子鞣质及没食子提取物2处理变形链球菌可明显抑制其在SHA上的粘附，其中没食子鞣质的抑制作用较没食子提取物2显著。没食子鞣质及没食子提取物2处理粘性放线菌不能有效抑制菌细胞对SHA的粘附(表1)。表1 没食子鞣质及没食子提取物2处理细菌对SHA的CPM值与其粘附抑制率
3 讨论
细菌粘附于牙面形成牙面生物膜和多种因素有关，细菌粘附是一个涉及多种机制的复杂过程，如细菌表面的粘结素、纤毛上的特异受体、疏水性和电极性反应，唾液成分也与粘附有关;如细菌可以通过特异性结合位点粘附于牙齿表面，富含脯氨酸蛋白能促进多种放线菌和格氏链球菌粘附。唾液富酪蛋白(Statherin)是获得性膜的组成成分之一，可以促进伴放线放线杆菌粘附。如果单纯某一种因素改变，未必能影响细菌粘附能力。细菌聚集粘附于牙面是一个涉及到多种机制的复杂的微生物学过程，任何因素干扰粘附过程，都可能打破细菌的共生平衡[3]。早期定植的细菌可能通过竞争同一粘附位点或为其它细菌提供粘附位点而影响后来定植细菌的粘附。所以，阻止一种细菌粘附，可以干扰后来细菌粘附甚至改变牙菌斑组成成分。
不同细菌其粘附能力、粘附机制不同，致龋能力也不同。变形链球菌是最早粘附于牙面的细菌之一，与龋病的发生发展有直接关系。变形链球菌对牙面有较高的亲和力，牙面是变形链球菌群在口腔内的主要定居部位。变形链球菌表面分布着大量的高分子类物质，如葡萄糖基转移酶、脂磷壁酸(LTA)和表面蛋白P1，对其初始粘附起着重要作用[4]。粘性放线菌表面的粘附素与牙面唾液蛋白受体发生特异性结合，从而介导该菌在牙面的粘附定居。研究表明，粘性放线菌的粘附素存在于细菌表面的菌毛上，其菌毛I蛋白促进细菌对获得性膜的粘附;菌毛II蛋白不但促进粘性放线菌对上皮细胞、一些细菌的粘附，也参与调节对获得性膜的粘附[5]。所以，阻止变形链球菌和粘性放线菌粘附对预防牙菌斑形成是十分有益的。本实验选择变形链球菌和粘性放线菌作为研究对象，结果表明，没食子鞣质及没食子提取物2处理变形链球菌可明显抑制其在SHA上的粘附，其中没食子鞣质的抑制作用较没食子提取物2显著。但没食子鞣质及没食子提取物2处理粘性放线菌不能有效抑制菌细胞对SHA的粘附。
本研究发现实验药物对与致龋密切相关的口腔细菌产糖、产酸以及粘附的抑制作用均表现出良好的效果。然而在自然状态下，细菌很少以纯培养游离形式存在，生物膜则是细菌最常见的生态环境。因此关于药物防龋的研究需要进一步从药物对细菌生物膜的形成、生物膜细菌组成和代谢、生物膜形态结构、生物膜的胞外基质的影响等方面进行深入研究,这样才能从本质上阐明药物对口腔细菌生物膜的作用机制。
【参考文献】
[1] 黄正蔚，周学东，李继遥. 中药影响变形链球菌对唾液获得性膜粘附的研究[J]. 四川大学学报(医学版), 2003,34(1):135-137.
[2] Liu T， Gibbons RJ, Hay DI. Streptococcus cricetus and Streptococcus rattus bind to different segments of collagen molecules[J]. Oral Microbiol Immunol, 1990, 5(3):143-148.
[3] Wong L, Sissons C, Sissions CH. A comparison of human dental plaque microcosm biofilms grown in an undefined medium and a chemically defined artificial saliva[J]. Arch Oral Biol, 2001, 46(6):477-86.
[4] Bennick A. Interaction of plant polyphenols with salivary proteins[J]. Crit Rev Oral Biol Med, 2002,13:184-196.
[5] Kolenbrander PE, Anderson RN, Blehert DS, et al. Communication among Oral Bacteria[J]. Microbiol Mpl Biol Rev, 2002, 66(3):486-488.