内容
作者：赵今 牛巧丽， 李 艳， 孙玉亮， 哈木拉提·吾甫尔 作者单位：1新疆医科大学第一附属医院口腔科, 2新疆医科大学, 新疆 乌鲁木齐
【摘要】 目的： 研究没食子及其提取物对致龋细菌生长的影响，探讨药物的防龋功效。方法：通过系统溶剂法对没食子浸膏及其3种提取物共4个组分,采用液体稀释法研究实验药物不同组分对变形链球菌、血液链球菌、内氏放线菌、粘性放线菌、乳酸杆菌5种主要致龋细菌生长的影响。结果：没食子浸膏和没食子总鞣质对细菌生长的抑制作用最强;提取物2对实验细菌的抑制作用较提取物3强 ,与总鞣质相当。结论：没食子及各提取物组分对口腔主要致龋细菌均有一定的抑制作用，但以总鞣质效果最好。
【关键词】 没食子; 龋病; 致龋细菌
(Department of Stomatology, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,
Urumqi 830011, China) Abstract: Objective： The purpose of this study was to investigate the role of different components of Turkish gall extract on the growth of 5 kinds of cariogenic bacteria, and to find out the most effective components of Turkish gall extract. Methods： Four different components Turkish gall, Turkish gall 1， Turkish gall 2 and Turkish gall 3 were separated from Turkish gall and there medicines to Streptococcus mutans ATCC25175, Streptococcus sanguis ATCC10556, Actinomyces naeslundii WVU627, Actinomyces viscosus ATCC19246 and Lactobacillus rhamnosus AC413 were checked. Results: The most effective part of Turkish gall was found to be Turkish gall and Turkish gall 1, which were found to be a mixture of tannin. All of the different components had an inhibitory effect to the growth of cariogenic bacteria. Conclusion： All of the 4 different components of Turkish gall extract could inhibit the growth of the tested bacteria. The most effective part of component was Turkish gall 1.
Key words: Turkish gall; caries; cariogenic bacteria
口腔是个多菌系的环境，健康状态下，口腔内的各种菌群趋于微生态平衡,当各种原因打破这种平衡，就可能发生龋病。龋病是发生于牙齿硬组织的慢性感染性疾病，是人类最常见的口腔疾病，发病率高，严重影响人类的口腔健康和全身健康。近年来国内外许多学者致力于防龋药物的研究，天然药物在龋病防治方面的研究倍受关注。天然药物包括植物药、动物药和矿物药等,其来源丰富、取材方便、用法简单、疗效显著且副作用甚微,有着广泛的临床应用基础。天然药物没食子(Turkish galls)中含有大量的可水解鞣质，其具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎的作用。有研究表明，没食子粗体物对口腔细菌有一定的抑制作用[1]。变形链球菌、血链球菌、粘性放线菌、内氏放线菌和乳酸杆菌是口腔主要可疑致龋细菌，本实验通过体外实验对没食子及提取物对5种口腔主要致龋细菌生长的作用进行研究,进一步明确药物的防龋功效,为实验药物的推广应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验菌株 变形链球菌 Streptococcus mutans ATCC 25175，血链球菌 Streptococcus sanguis ATCC 10556，内氏放线菌 Actinomyces naeslundii WVU 627，粘性放线菌 Actinomyces viscosus ATCC 19246，乳酸杆菌 Lactobacillus rhamnosus AC 413，实验菌株由口腔生物医学工程教育部重点实验提供。
1.2 菌悬液制备 将复苏48 h后的各株细菌分别接种于BHI液体培养基中，在80% N2、20% CO2、37℃条件下厌氧培养18 ～24 h，涂片检查为纯培养后，使用Crystal SpecTM比浊仪(美国 Becton Dickinson and Company)测定菌悬液浓度，用BHI将菌悬液浓度调至1.0 McFarland(3×108 CFU/ml)备用。
1.3 没食子及提取物实验药液的制备 实验使用的药物为没食子粗提物(浸膏)、没食子提取物1(总鞣质)、没食子提取物2(没食子酸+没食子酸甲酯)和没食子提取物3(1，2，3，6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖)，先用水将各实验药物配制成128.000 mg/ml的母药液放置冰箱(4℃)备用。
1.4 实验分组 阴性对照组：含实验药液的BHI液体培养基，每组2个平行;阳性对照组：含菌悬液的BHI液体培养基，每组2个平行; 实验组：含实验药液和菌悬液BHI液体培养基，每组2个平行。
1.5 实验药物对口腔致龋细菌最低抑制浓度(MIC)的测定 将母药液按2倍稀释法溶于BHI液体培养基中，使其最终浓度达到32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250 mg/ml。将细菌悬液与各组药液按1∶1(v/ v) 比例，各100 μl分别接种于96孔板中, 用微量震荡器震荡1 min后，置于80% N2、20% CO2、37℃条件下厌氧培养24 h。在黑色背景下，以肉眼观察无浑浊出现的最低药物浓度为其最低抑菌浓度(MIC)值;结果不易判断，则将96孔板用微量震荡器震荡5 min，以接种环挑少量菌液接种于BHI固体培养基上，80% N2、20% CO2、37℃下厌氧培养24 h，观察是否有菌落生长[2]。MIC测定重复3次。
2 结果
各实验药物能有效抑制与龋病发生密切相关的5种口腔细菌的生长，各实验药物对实验菌株的生长抑制作用有一定差异，没食子粗提物与没食子提取物1对口腔致龋细菌生长抑制作用较强(表1)。表1 实验药物分对口腔致龋细菌生长的MIC值
3 讨论
许多天然药物都具有较强的防龋作用，如茶多酚等能抑制口腔细菌的产糖与产酸[3]。没食子具有收敛止汗、抗菌抑菌、抗病毒、清除自由基和抗氧化的作用。有研究表明，没食子粗体物对口腔细菌有一定的抑制作用，对牙本质龋胶原的分解有抑制作用[1]。本实验结果表明，没食子浸膏和没食子总鞣质对口腔致龋细菌生长具有较强的抑制作用。没食子的主要化学成分是水解性没食子鞣酸，鞣质可抑制口腔中变形链球菌、粘性放线菌、唾液链球菌等多种细菌的生长，可降低牙菌斑的聚集，抑制葡萄糖基转移酶(GTF)活性，进而影响致龋菌生长代谢。研究证实没食子鞣酸成分能通过抑制细菌产生水不溶性胞外多糖的关键酶-GTF的活性，在菌斑形成的早期能减少粘附细菌的数量，也可通过细菌间的相互聚集而从口腔中清除，没食子鞣质的这些作用可能是它与蛋白质结合而使之沉淀，也就是鞣质的收敛性所致[4]。本研究证实了鞣质的作用。可以推测，没食子对细菌的抑制作用主要通过抑制细菌代谢所需的酶类而产生，而对细菌没有直接杀灭作用。
没食子提取物2为没食子酸和没食子酸甲酯的混合物。没食子酸(gallic acid, GA), 化学名3,4,52三羟基苯甲酸，是可水解鞣质的组成部分，广泛存在于葡萄、茶叶等植物中，是自然界存在的一种多酚类化合物。已有文献证实GA具有抗炎、抗突变、抗氧化等多种生物学活性[5]。没食子酸甲酯(methyl gallate， MG)也存在于多种植物体内，随着对天然药物的开发利用，其生理药理作用得到了广泛的关注。早在1988年Kane就报道过，没食子酸甲酯0.224 mg/ml即可有效抑制单纯疱疹病毒的生长，HSV-2型较HSV-1型更为敏感，没食子酸甲酯可能通过与病毒蛋白相互作用，改变病毒颗粒对细胞的穿透能力而发挥作用。没食子酸甲酯还具有松弛作用，Paulino等[6]在体外试验中发现没食子酸甲酯可以对由组胺造成的豚鼠的气管收缩起松弛作用，而80 mM K+ 可以拮抗由没食子酸甲酯造成的松弛作用，因此推测没食子酸甲酯通过改变细胞高通量钙离子激活钾离子通道及ATP-敏感钾离子通道而起作用。Kato等[7]的研究表明，没食子酸甲酯可以选择性的抑制蛋白激酶Th2，没食子酸甲酯10 mg/ml可显著抑制T淋巴细胞分泌IL-4、IL-5、蛋白激酶Th2，但不能降低IFN-gamma。Hsieh等[8]通过比较没食子酸甲酯与抗氧化剂Trolox的抗氧化性能发现没食子酸甲酯能有效预防考克斯班尼犬肾脏细胞由过氧化氢导致的氧化刺激和DNA损伤。推测其机制为参与了清除细胞内氧化反应物质，抑制脂质的过氧化反应，防止细胞内由过氧化氢引起的谷胱甘肽的损耗。而没食子酸甲酯对致龋菌的作用还未见报道。本研究发现没食子提取物2(没食子酸和没食子酸甲酯的混和物)可以有效抑制致龋菌的生长，但是没食子酸和没食子酸甲酯分别作用于口腔细菌的抑制作用均没有没食子酸和没食子酸甲酯的混和物的作用明显，两者之间是否存在协同效应还不十分清楚，还需要进一步研究。
【参考文献】
[1] 谢 倩，李继遥，左渝陵，等. 天然药物五倍子提取物对致龋菌生长的影响[J].华西口腔医学杂志，2005，23(1)：82-84.
[2] 周学东，肖晓蓉.口腔微生物[M].成都：四川大学出版社，2002:384-392.
[3] 肖 悦，刘天佳，黄正蔚,等.天然药物对粘性放线菌生长和产酸影响的体外研究[J].华西医大学报，2002,33(2): 253-255.
[4] 石 碧，狄 莹，何有节,等.鞣质的药理活性[J].中草药,1998,29(7)：487.
[5] Kane C, Menna JH, Sung CC, et al. Methyl gallate, methyl-3,4,5-trihydoxy- benzoate, is a potent and highly specific inhibitor of herpes simplex virus in vitro. II. Antiviral activity of methyl gallate and its derivatives [J]. Biosci Rep, 1988, 8(1): 95-102.
[6] Paulino N, Pizollatti MG, Yunes RA, et al. The mechanisms underlying the relaxant effect of methyl and ethyl gallates in the guinea pig trachea in vitro: contribution of potassium channels [J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1999, 360(3): 331-336.
[7] Kato K, Yamashita S, Kitanaka S, et al. Effect of gallic acid derivatives on secretion of Th1 cytokines and Th2 cytokines from anti CD3-stimulated spleen cells [J] .Yakugaku Zasshi, 2001, 121(6):451-457.
[8] Hsieh TJ, Liu TZ, Chia YC, et al. Protective effect of methyl gallate from Toona sinensis (Meliaceae) against hydrogen peroxide-induced oxidative stress and DNA damage in MDCK cells [J]. Food Chem Toxicol, 2004, 42(5): 843-850.