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异常黑胆质证载体大鼠模型的建立及其免疫、内分泌紊乱状态的研究

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作者：张有辉, 哈木拉提·吾甫尔, 玉苏甫·吐尔逊, 阿不都卡德尔·库尔班,阿布力孜·阿卜杜扎依尔, 斯坎德尔·白克力张有辉(1983-)，男，在读硕士研究生，研究方向：维医维药与疾病。作者单位：(新疆医科大学　基础医学院生物化学与分子生物学教研室, 维吾尔医学系, 药学院, 新疆乌鲁木齐830011) 国家杰出青年科学基金(30525023)
　　【摘要】目的建立维吾尔医异常黑胆质证载体大鼠模型，并探讨其免疫、内分泌的紊乱状态。方法雄性Wistar大鼠20只, 稳定饲养3 d后随机分为正常对照组(10只)和模型组(10只),其中模型组根据维吾尔医学理论，采用干寒饲养环境、干寒属性的饲料、慢性间断足底电刺激、强迫游泳、制动等多因素复合作用3周，建立维吾尔医异常黑胆质证载体大鼠模型，动态观察模型组大鼠一般状态、体重、饮食量、饮水量和舌苔的变化;检测外周血白细胞介素1β(IL1β)、白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(CORT)等免疫、内分泌指标的变化。结果与正常对照组相比，模型组动物的一般状态与异常黑胆质证候特征相一致。第11天至第21天体重增长速度慢，自第7天至第21天饮食量、饮水量增多，差异有统计学意义(P 0.01)。与正常对照组相比，模型组动物血清ACTH、CORT、IL1β水平均降低，差异有统计学意义(P 0.05~0.01),IL6水平降低，但差异无统计学意义(P 0.05),TNFα水平升高,差异有统计学意义(P 0.05)。结论异常黑胆质证载体大鼠模型的一般状态、体重、饮食量、饮水量的变化与临床患者以及小鼠动物模型中异常黑胆质证相似，并且其免疫、内分泌处于紊乱状态。
　　【关键词】异常黑胆质; 维吾尔医学; 动物模型
　　Establishment of abnormal savda syndrome rat model and study on its disordered immuneendocrine network
　　ZHANG Youhui, Halmurat·Upur, Yusup·Tursun, et al
　　(Department of Biochemistry, Preclinical Medicine College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)
　　Abstract: ObjectiveTo establish a rat model of abnormal savda syndrome in Uygur medicine and investigate its disordered immuneendocrine network. MethodsMale Wistar rats (n=20)， were randomly divided into control group (n=10) and model group (n=10) after stable feeding 3 d. According to the theory of Uygur medicine, model group rats were fed with coldnatured diet under cool dry environment, stimulated with chronics and interrupted electric foot shocks, enforced swimming and controlled movement to establish abnormal savda syndrome rat model for three weeks, rats′ behavior, body weight, daily food intake, daily water intake, state of tongue were observed. The concentrations of immuneendocrine related indexes including Interleukin1β (IL1β), Interleukin6 (IL6), Tumor necrosis factorα (TNFα), Adrenocorticotropic Hormone (ACTH) and Cortisol (CORT) in serum were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method. ResultsCompared with the control group, the model group developed abnormal savda syndrome like slow weight gaining, more diet, more drink. Compared with the control group, the serum level of ACTH， CORT， IL1β in model group decreased，and the differences had statistical significance (P 0.05~ 0.01); the serum level of IL6 in model group decreased，but the differences had no statistical significance (P 0.05); the serum level of TNFα increased, and the differences had statistical significance (P 0.05). ConclusionThe changes of body weight, daily food intake, daily water intake of abnormal savda syndrome rat model are similar to the feature of human abnormal savda syndrome and the abnormal savda syndrome model of ICR mice. Abnormal savda syndrome rat model developes disordered immuneendocrine network.
　　Key words: abnormal savda; Uygur medicine; animal model
　　维吾尔医学认为异常黑胆质是在各种内外因素的作用下，体液质平衡紊乱，体液质被燃烧，继而沉淀的最终病理产物或表现形式。长期受到慢性刺激、进食干寒属性的饲料、处于干寒的环境是异常黑胆质证发生的主要起因[1-2]。随着维吾尔医学的深入研究,需要建立具有维吾尔医学证候特征的大鼠模型,以便运用现代科学手段研究维吾尔医学。本研究以维吾尔医学理论为指导，采用干寒饲养环境、干寒属性的饲料、慢性间断足底电刺激、强迫游泳和制动等多因素复合作用3周，建立维吾尔医异常黑胆质证载体大鼠模型，并检测其外周血白细胞介素1β(IL1β)、白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(CORT)等免疫、内分泌指标的变化，探讨其免疫、内分泌的紊乱状态。
　　1　材料与方法
　　1.1　材料
　　1.1.1　实验动物Wistar大鼠20只,清洁级,雄性,体重(150±30)g,由新疆医科大学实验动物中心提供。
　　1.1.2　主要仪器
　　RQH350 型人工气候箱(上海精宏实验设备有限公司); JXDT1型小鼠跳台仪;BS110型电子天平(北京赛多科斯天平有限公司)，低温超速离心机(美国Beckman公司产品)。
　　1.1.3　主要试剂
　　大鼠血清ACTH、CORT放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所)，IL1β、IL6、TNFα酶联免疫试剂盒(美国R D公司)，其他试剂均为国产分析纯试剂。
　　1.2　方法
　　1.2.1　动物分组和处理
　　健康雄性Wistar大鼠共20只,体重(150±30) g,每笼5只, 普通环境，自然光照，自由进食水。实验前对每只动物进行一般状态的观察并记录,舌象每天拍照1 次。稳定饲养3 d后随机分为正常对照组(10只)和模型组(10只),正常对照组正常饲养(每笼普通鼠饲料250 g/d、灭菌食用水500 ml/d,随机饮食水)，未受任何刺激,室温下喂养, 温度(25±3) ℃,相对湿度60%～80%。
　　1.2.2　异常黑胆质证载体大鼠模型的制作
　　1.2.2.1　干寒饲养环境
　　按照文献[34]和维吾尔医学异常体液与环境的关系,将实验动物置于适宜的喂养环境。采用人工气候箱模拟干寒环境,温度(6±1)℃,相对湿度25%～32.8%,每日11∶00 AM～9∶00 PM将模型组动物置于人工气候箱中。正常对照组与模型组均从6∶00 AM～6∶00 PM 提供光线。
　　1.2.2.2　干寒属性的饲料在普通鼠饲料中按每公斤7∶3的比例加入相等比例的芫荽子和大麦,然后制成颗粒状干饲料,委托新疆维吾尔自治区实验动物中心加工。喂养方法根据文献[5]并适当改进,每笼实验动物提供饲料250 g/d、灭菌食用水500 ml/d。
　　1.2.2.3　慢性间断足底电刺激按照文献[69]并略加改进,采用间断足底电刺激(第1周每次30 min、电压35 V、1次/d;第2周每次35 min、电压40 V、1次/d;第3周每次45 min、电压45 V、1次/d)，产生慢性应激。
　　1.2.2.4　制动将大鼠放入大鼠固定器中，水平置于实验台，保证大鼠不受压，以不能回转为度，但其运动受制动。
　　1.2.2.5　强迫游泳大鼠每日置于水温(25±1)℃的水中强迫游泳5 min, 待毛发变干后放回饲养室。
　　1.3　观察指标
　　1.3.1　一般状态建模前后动物的舌苔、体形、皮肤毛发、行为状态、情绪反应、兴奋程度、睡眠状态、体重、饮食量和饮水量的变化。
　　1.3.2　定量指标(1)体重: 每天施加刺激因素后，正常对照组和模型组禁食4 h，然后称量每只大鼠体重并记录。(2)饮食量:每日2∶00 PM 加饲料250 g,次日10∶00 AM 称饲料余量(总饮食量),根据下述公式计算每100 g体重相对应的饮食量并记录：每100 g体重的饮食量= (100 g×总饮食量)/总体重。(3)饮水量:每日2∶00 PM给水500 ml,次日10∶00 AM称剩余水量(总饮水量),根据下述公式计算每100 g体重相对应的饮水量并记录：每100 g体重的饮水量= (100 g×总饮水量)/总体重。(4)实验结束后，在麻醉状态下取血，颈椎脱臼处死所有动物，4 ℃离心分离血清，分别采用大鼠ACTH、CORT放射免疫试剂盒，IL1β、IL6、 TNFα酶联免疫试剂盒检测各项指标[10-11]。
　　1.4　统计学处理采用SPSS16.0软件处理, 饮食量、饮水量数据以均数±标准差(±s)表示,采用t检验进行差异分析，体重按重复测量资料的方差分析法进行差异分析,检验水准α = 0.05。
　　2　结果
　　2.1　一般状态的变化与正常对照组相比，模型组动物的体形明显偏瘦，毛发手感粗糙，观之无光泽、易掉，性情急躁易激惹，争食争水现象明显，行动较迟缓，易倦怠，睡眠浅且易醒，皮温较低，大便干燥，体重增长速度缓慢,饮食量、饮水量增多,舌暗紫有瘀斑(图1)。
　　2.2　2组体重的变化造模前，模型组与正常对照组大鼠体重差异无统计学意义(P 0.05)。从造模第11天至第21天，模型组大鼠体重明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P 0.01)(表1)。表1造模前和造模期2组体重变化(略)
　　2.3　2组每100 g体重饮食量变化造模第3天，模型组与正常对照组大鼠饮食量差异无统计学意义(P 0.05);从造模第7天开始，模型组大鼠饮食量比正常对照组大鼠逐渐增多，到造模第21天，模型组大鼠饮食量与正常对照组相比，差异均有统计学意义(P 0.01)(表2)。表2　造模期2组饮食量变化(略)
　　2.4　2组每100 g体重饮水量变化造模第3天，模型组与正常对照组大鼠饮水量差异无统计学意义(P 0.05);从造模第7天开始到造模第21天，模型组大鼠饮水量与正常对照组相比，差异均有统计学意义(P 0.01)(表3)。表3造模期2组饮水量变化(略)
　　2.5　2组免疫、内分泌指标变化与正常对照组相比，模型组大鼠的血清ACTH、CORT和IL1β水平均降低，差异有统计学意义(P 0.05~0.01)，IL6水平也降低，但差异无统计学意义(P 0.05)， TNFα水平升高, 差异有统计学意义(P 0.05) (表4)。表4异常黑胆质载体动物免疫、内分泌指标的变化(略)
　　3　讨论
　　维吾尔医学认为异常黑胆质是在各种内外因素的作用下，体液质平衡紊乱，体液质被燃烧，继而沉淀的最终病理产物或表现形式，是哮喘、肿瘤、糖尿病和高血压等复杂性疾病的主要原因。环境、饮食、精神等因素是导致异常黑胆质证发生的主要起因。异常黑胆质病证的临床表现主要有欲饮多食、舌暗有瘀斑、苔色灰暗、形体消瘦等。异常黑胆质作用于肝脏减弱肝脏自然力的功能,产生未成熟体液,由于这种未成熟的体液不具备营养功能,故可使机体出现形体消瘦。如异常黑胆质影响被支配器官胃肠道及脾等时则出现苔色灰暗，而刺激胃肠道则可形成 “假胃口”,出现欲饮多食[12]。在以往对异常黑胆质载体动物模型的研究中发现，模型动物的神经内分泌免疫网络是紊乱的，免疫功能是低下的。本实验结果表明,在造模起始阶段，正常对照组、模型组动物的体重、饮食量、饮水量无差异，在施加刺激因素(干寒喂养环境、干寒属性的饲料、慢性间断足底电刺激、强迫游泳及制动)后，模型组与对照组的体重在第11天时差异就有统计学意义(P 0.01)，饮食量、饮水量在第7天时差异均有统计学意义(P 0.01)，至第21天造模结束时差异更为显著。观察舌苔舌象，造模第7天开始模型组大鼠出现舌暗紫、苔湿(类滑苔)，造模第14天后表现为舌干暗紫、瘀斑加重、暗灰色苔、舌面干燥。ACTH、CORT、IL1β、IL6和TNFα作为机体重要的免疫、内分泌功能的部分指标，其水平的改变在一定程度上体现了免疫内分泌功能的状态，通过分析这些相关指标检测结果我们发现，与正常对照组相比，模型组动物的血清ACTH、CORT、IL1β、IL6水平是降低的，TNFα水平是升高的，除IL6差异无统计学意义外，其余差异均有统计学意义(P 0.05~0.01)。因此我们认为，异常黑胆质体液可能作为慢性应激刺激源损伤了下丘脑—垂体—肾上腺轴(HPAA)，使其分泌的激素水平降低。同时，这种神经内分泌系统的抑制、紊乱状态导致其调节机体免疫功能的作用受到抑制，免疫系统也处于一种抑制、紊乱的状态之中，分泌细胞因子IL1β、IL6减少，TNFα水平升高。在维吾尔医学基础理论中，长期处于干寒环境、长期食用干寒属性的饮食、长期受到不可预见的精神刺激、长期过度疲劳都是产生并堆积异常黑胆质体液的主要原因。在动物身上施加上述因素时,动物体内干寒气质占优势逐渐形成黑胆质体液而且量会增加,正常体液质动态平衡紊乱,导致其他体液质燃烧,最终形成异常黑胆质体液。异常黑胆质的产生可使HPAA内分泌障碍，反馈调节机制破坏，从而导致HPAA功能的紊乱，HPAA功能的紊乱又会导致机体的免疫功能发生异常，这种神经内分泌免疫网络功能的紊乱状态又反过来加重了异常黑胆质证。综上,认为采用上述多因素复合作用所建立的异常黑胆质证载体大鼠模型的一般状态、舌苔、体重、饮食、饮水等方面的表现符合人体异常黑胆质证侯的临床表现，其免疫、内分泌处于紊乱状态，是一种十分有益的证候动物模型，为异常黑胆质证本质、异常黑胆质证载体肿瘤、糖尿病、高血压等病证动物模型的建立及药物治疗干预机制等研究提供实验基础。
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