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内脂素基因在3T3L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

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作者：孙丽丽，焦谊，王延蛟，刘晓宇，张成，关亚群孙丽丽(1980-)，女，硕士研究生，研究方向：肥胖和代谢综合征的分子生物学机制研究。作者单位：(新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，新疆乌鲁木齐830011;新疆维吾尔自治区人民医院，新疆乌鲁木齐830000) 国家自然科学基金(30960363)
　　【摘要】目的观察3T3L1前脂肪细胞诱导分化过程的不同时段内脂素基因表达水平的变化，探讨内脂素基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法体外培养3T3L1前脂肪细胞，在该细胞生长至完全汇合(confluent)后2 d，采用经典的鸡尾酒方法诱导其分化，并于诱导分化过程中用油红O染色鉴定脂肪细胞分化情况，采用RTPCR和Western blot技术检测内脂素基因表达的变化规律。结果油红O染色显示，细胞内脂滴逐渐增大、增多，至分化末期占视野90%以上。内脂素基因在诱导分化初期不表达，分化第2天开始表达，分化第4～8天表达显著上调，分化至第10～12天，内脂素基因表达保持在较高水平并趋于稳定。其中，诱导分化后第6～12天较分化第0天显著升高(P 0.05)，诱导分化第10～12天较第2～6天显著升高，诱导分化第12天较第6～8天显著升高(P 0.05)。Western blot方法检测结果显示，随细胞分化成熟内脂素蛋白表达水平逐渐升高。结论内脂素基因与脂肪细胞分化和脂质积聚有密切的关系。
　　【关键词】内脂素; 3T3L1前脂肪细胞; 逆转录聚合酶链反应; 免疫印迹; 肥胖
　　Visfatin gene expression during the period of 3T3L1 preadipocyte differentiation
　　SUN Lili, JIAO Yi, WANG Yanjiao, et al
　　(Department of Biochemistry, Preclinical Medicine College, Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China)
　　Abstract: ObjectiveTo observe the expression changes of visfatin mRNA and protein during the differentiation of 3T3L1 preadipocytes, so as to explore the relationship between visfatin and adipocytes differentiation. Methods3T3L1 preadipocytes were cultured in vitro and were induced to differentiate into mature adipocytes; Oil red O dye was used to observe the process of differentiation. Expression of visfatin in adipocytes was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) and Wesern blot during differentiation. ResultsWith the progression of 3T3L1 cell differentiation, oil red O staining showed that the lipid droplets increased gradually to 90% of the vision field. The expression of visfatin mRNA and protein increased gradually in 3T3L1 preadipocytes with their differentiation and maturation. The expression reached highest level in mature adipocytes. Expression level of visfatin mRNA from the sixth day to 12 th day was higher than 0 day, from the 10 th to 12 th day the expression of visfatin was higher than from the second day to sixth day, the 12 th day expression of visfatin was higher than from 6 th day to 8 th day. Expression of visfatin mRNA and protein increases during the differentiation of preadipocytes. ConclusionIt suggests the proliferation and maturation of the preadipocytes have close relationship.
　　Key words: visfatin; 3T3L1 preadipocyte; reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR); Western blot; obesity
　　内脂素(visfatin)是2005年日本学者Fukuhara等[1]采用差异显示方法在比较2位女性内脏脂肪和皮下脂肪标本的8 800对PCR产物中发现的一种内脏脂肪中高表达的脂肪细胞因子。该因子能够促进脂肪组织分化、合成及积聚，还具有类胰岛素样作用，同时在胰岛素信号转导中发挥作用。研究显示[1-3]，内脂素与肥胖症密切相关，然而肥胖又是心血管疾病、糖尿病、代谢综合征等多种疾病的高危因素，因此该细胞因子备受关注。本研究以3T3L1脂肪细胞为研究对象，采用RTPCR和Western blot方法，观察内脂素基因在脂肪细胞诱导分化不同时段mRNA和蛋白水平的表达情况，旨在探讨内脂素基因与脂肪细胞分化、脂质积聚及肥胖发生之间的关系。
　　1　材料与方法
　　1.1　材料
　　3T3L1前脂肪细胞购自中科院上海细胞研究所，DMEM 高糖培养基购自GIBCO公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司，胰蛋白酶、胰岛素、地塞米松、3异丁基1甲基黄嘌呤(IBMX)、油红O染料购自美国Sigma公司，小鼠内脂素抗体购自Abcom公司，βactin购自德国Merker公司。
　　1.2　方法
　　1.2.13T3L1前脂肪细胞的培养和诱导分化
　　将3T3L1前脂肪细胞接种于6孔培养板中，用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖完全培养基，在5%CO2的37℃恒温培养箱中培养，每2天换完全培养基1次，待细胞汇合(confluent)2 d后(第0天)，开始采用经典的鸡尾酒法[4]诱导其分化(含有0.5 mM IBMX、2.5 μM地塞米松、5 μg/ml胰岛素、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基)48 h，换以含5 μg/ml胰岛素的完全培养基诱导48 h，随后使用完全培养基继续培养，每2天换完全培养基1次，诱导分化12 d，90%以上的3T3L1前脂肪细胞株分化成脂肪细胞。
　　1.2.2　油红O染色弃去培养基，用冷的PBS洗细胞3次。用4%甲醛固定细胞30 min，PBS洗3次，然后加配置好的0.18%油红O 染色于细胞表面，染色1 h。弃油红O染液，用70%酒精分色20 s。用蒸馏水冲洗数次至背景透明，用苏木精染细胞核2 min，用蒸馏水冲洗数次至背景透明，于倒置显微镜下观察并留取图像。
　　1.2.3　脂肪细胞总RNA提取
　　收集各时间点的细胞，采用经典的Trizol法提取总RNA，Gene Quant pro紫外分光光度计测定RNA 的浓度和纯度，确保A260/A280 1.8，1%的琼脂糖凝胶鉴定RNA的完整性。
　　1.2.4　脂肪细胞蛋白质的提取
　　弃去培养基，用冷的PBS清洗细胞3遍，用0.25%的胰蛋白酶消化1～2 min，用PBS将贴壁细胞吹打下来，将细胞转移到离心管中，5 000 r/min离心5 min，弃尽PBS，加入25～30 μl细胞裂解液，在冰上裂解细胞30 min。4℃ 12 000 r/min离心15 min，留取上清备用。采用BCA法测定内脂素蛋白质浓度。
　　1.2.5　内脂素基因mRNA表达的检测
　　(1) 根据小鼠内脂素和βactin cDNA序列，应用primer 5.0设计引物，由上海生工生物有限公司合成。引物序列如下：小鼠内脂素的上游引物序列：5′CGA AAG AGG ATG GAA CTA3′，下游序列：5′GAT ACC AGG ACT GAA CAA GA 3′,扩增长度为182 bp;小鼠βactin 上游引物序列：5′AGG TCA TCA CTA TTG GCA AC 3′，下游引物序列：5′ACT CAT CGT ACT CCT GCT TG3′,扩增长度为357 bp。(2) 扩增参数：小鼠3T3L1前脂肪细胞的内脂素基因与βactin基因的扩增条件一致为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环，72℃总延伸7 min。(3) RTPCR半定量：取扩增产物5 μl置于含溴化乙锭的2.0%琼脂糖凝胶中电泳，采用BioRad凝胶成像仪成像，根据电泳条带的面积和亮度计算出每个条带的积分光密度，以待测基因内脂素的光密度对同一标本βactin(内参照)光密度的比值表示该细胞因子mRNA的表达水平。
　　1.2.6　内脂素基因蛋白表达的检测
　　制备12%的分离胶和5%的浓缩胶;每孔加入30 μg蛋白样品;12 mA 稳流电泳3.5～4 h;30 V稳压转膜大约12 h;3% BSA 封闭12 h;孵育抗体：其中一抗(内脂素一抗浓度1.25∶1 000 μl;βactin一抗浓度1∶5 000 μl)4℃孵育48 h;二抗(内脂素二抗浓度1∶5 000 μl;βactin浓度 1∶5 000 μl)4℃孵育12 h。ECL发光法检测内脂素蛋白的表达情况。
　　1.3　统计学处理
　　采用SPSS16.0软件进行处理，所有计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
　　2　结果
　　2.1　3T3L1前脂肪细胞在诱导分化不同阶段油红O染色结果采用经典的鸡尾酒法诱导3T3L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，油红O染色可鉴定3T3L1前脂肪细胞诱导分化过程中细胞形态变化:复苏后细胞贴壁呈长梭形，胞浆内未见亮红色脂滴。待细胞生长至完全汇合后2 d(第0天)开始加入诱导液，第2天到第4天细胞形态发生明显变化，细胞体积增大，逐渐由梭形变成为圆形，可见少数细胞的胞浆内开始出现亮红的小脂滴。第6天时，可见50%以上的细胞已分化成熟。第12天时，含有亮红色脂滴的成熟脂肪细胞占视野90%以上，且细胞体积大、形态圆(图1)。
　　2.2　3T3L1前脂肪细胞在诱导分化不同时段内脂素mRNA水平表达情况内脂素mRNA表达在3T3L1前脂肪细胞分化过程中逐渐升高，至分化末期达到较高水平且趋于稳定。其中，诱导分化后第6～12天较分化第0天显著升高(P 0.05)，诱导分化第10～12天较第2～6天显著升高(P 0.05)。诱导分化第12天较第6～8天显著升高(P 0.05)(表1、图2)。表1　3T3L1前脂肪细胞诱导分化不同时段内脂素(略)
　　2.3　Western blot 结果免疫印迹结果显示，随着脂肪细胞的成熟,内脂素蛋白水平的表达逐渐升高(图3)。内脂素蛋白表达量1～7：分别表示诱导分化第0、2、4、6、8、10、12天内脂素蛋白表达量3讨论肥胖症是机体脂肪细胞肥大、数目增多及脂肪堆积和分布异常的一种疾病，是导致心脑血管疾病的高危因素，增加了糖尿病、高血压、高脂血症等多种疾病的发病率。目前，肥胖症已被世界卫生组织列为与癌症并列的21世纪威胁人类健康的最严重的疾病。脂肪组织在肥胖症的发生发展过程中扮演着重要的生物学角色，作为人体最大的能量贮存器官，一方面它对于维持机体的能量代谢平衡发挥着重要作用，另一方面脂肪细胞增殖、分化失常引起脂肪组织的过多堆积，导致肥胖的发生，其核心环节在于前脂肪细胞的过度增殖和分化，生成了过多的脂肪细胞[5-6]。成熟的脂肪细胞是终末分化细胞，不再具备增殖和分化能力，因此在体内研究脂肪细胞的增殖与分化非常困难，目前多采用小鼠的成纤维细胞3T3L1细胞株，3T3L1细胞具有定向分化为成熟的脂肪细胞的能力。在体外，该细胞在汇合成单层的情况下，可以分化并形成与正常脂肪组织无明显差别的脂肪团块，具有活体脂肪组织的功能。因此，本研究利用3T3L1细胞株作为体外实验模型，通过观察3T3L1前脂肪细胞分化成熟过程中内脂素基因表达水平的变化，探讨内脂素与脂肪细胞分化、脂质积聚及肥胖发生之间的关系。本研究发现，随着细胞分化成熟，细胞内脂滴逐渐增大、增多，至分化末期占视野90%以上。内脂素基因在诱导分化初期不表达，分化第2天开始表达，分化第4～8天表达显著上调，分化至第10～12天，内脂素基因表达保持在较高水平并趋于稳定。此结果与Fukuhara等[1]和陈小慧等[7]的报道一致，表明内脂素mRNA的表达与脂肪细胞分化和脂质积聚有着紧密的联系，其机制可能是，内脂素具有拟胰岛素活性，可结合并活化胰岛素受体，活化信号转导通路促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取，促进培养基中葡萄糖转化为甘油三酯，促进甘油三酯在前脂肪细胞中聚集。内脂素在脂肪的堆积和脂质形成过程中起到一定的作用，与肥胖症的发病相关。Kitani等[8]发现内脂素不仅存在于细胞质，而且还存在于细胞核，神经生长因子处理的3T3L1细胞生长至汇合状态时，胞核中内脂素量高于胞质，推测内脂素是一种与细胞周期有关的蛋白。本研究发现内脂素mRNA水平随3T3L1细胞分化成熟表达量逐渐增加，内脂素在脂肪细胞分化过程以及在细胞周期中所发挥的调控作用和信号转导通路是一个值得探讨的问题。本研究采用Western blot方法检测3T3L1前脂肪细胞诱导分化过程中内脂素蛋白质分泌水平变化，观察到随细胞逐渐分化成熟，胞内脂质不断积聚内脂素蛋白分泌水平逐渐升高，此结果与mRNA表达水平检测结果一致，过多的脂肪细胞分化则是肥胖发生发展过中重要的病理生理学基础[9]。因此，上述研究结果提示肥胖患者体内过多脂肪细胞的分化成熟与脂质积聚可能伴有内脂素基因表达的显著上调。本研究在转录和翻译水平都发现内脂素的表达随脂肪细胞的分化成熟而逐渐增多。提示内脂素基因可能参与了脂肪细胞分化的调控过程，与脂肪细胞的定向分化有关，但是内脂素基因是如何调控脂肪细胞分化成熟，并且在肥胖症发生发展过程中的作用机制有待于深入研究。总之，本研究通过对内脂素基因在3T3L1前脂肪细胞诱导分化过程表达变化的检测，发现内脂素基因与脂肪细胞分化、脂质积聚及肥胖发生之间有着密切的关系，但内脂素在肥胖发病过程中的作用机制还有待于深入研究。
　　【参考文献】
　　[1]Fukuhara A, Matsuda M, Nishizawa M, et al. Visfatin a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J]. Science, 2005:307426.
　　[2]Daniel L, Michele P, Gerard S, et al. Visfatin:The link between inflammation and childhood obesity[J]. Diabetes Care, 2009,32(6):e71.
　　[3]Haider DG, Schindler K, Schaller G, et al. Increased plasma visfatin concentrations in morbidly obese subjects are reduced after gastric banding[J]. Clin Endocrinol Metab, 2006, 91(4):15781581.
　　[4]Ntambi JM, Kim YC. Adipocyte differentiation and gene expression[J]. J Nutr,2000,130(12):3122s3126s.
　　[5]Spiegelman BM, Flier JS. Obesity and the relation of energy balance[J]. Cell, 2001, 104:531543.
　　[6]Prins JB, O’Rahilly S. Regulation of adipose cell number in man[J]. Clin Sci, 1997, 92:311.
　　[7]陈小慧，张敏，池霞, 等. visfatin 在3T3L1脂肪细胞诱导分化过程中的分泌变化及胰岛素的调节作用[J].实用儿科临床杂志,2009,1(24):4850.
　　[8]Kitani T, Okuno S, Fujisawa H. Growth phasedependent changes in the subcellular localization of preBcell colonyenhancing factor[J]. FEBS Lee, 2003, 544(13):7478.
　　[9]Kokkoris P, PiSunyer FX. Obesity and endocrine disease[J]. Endocrinol Metab Clin North Am,2003,32(4):895914.

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