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大鼠溃疡性结肠炎的代谢组学研究

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作者：努尔比亚·吾布力　库热西·玉努斯买买提卡斯木·吾布力艾山　连静静哈木拉提·吾甫尔努尔比亚·吾布力(1985-), 女(维吾尔族)，在读硕士研究生，研究方向：维医与维药分子生物学。作者单位：(新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室, 新疆乌鲁木齐830011; 新疆维吾尔医学专科学校，新疆和田848000; 新疆地方病分子生物学重点实验室，新疆乌鲁木齐830011) 国家自然科学基金(30460163)
　　【摘要】目的应用代谢组学研究技术探讨大鼠溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)相关的小分子标志物。方法Wistar大鼠随机分为溃疡性结肠炎模型组(21只)和正常对照组(7只)，并采用2,4二硝基氯苯(2,4dinitrochlorobenzene，DNCB)复合乙酸法建立溃疡性结肠炎大鼠模型，收集正常对照组和模型组大鼠血浆，进行1HNMR谱测定和主成分分析。结果与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血浆中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等支链氨基酸、苯丙氨酸、丙酮酸、β羟丁酸、肌酸等小分子化合物含量明显降低，而VLDL含量升高，差异有统计学意义(P 0.05)。结论UC大鼠血浆的代谢谱明显偏离正常大鼠，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙酮酸有可能作为溃疡性结肠炎早期诊断的分子标志物。
　　【关键词】溃疡性结肠炎; 代谢组学; 分子标记物
　　The metabonomics research of the ulcerative colitis rat
　　Nurbiya·Ubuli, Kurexi·Yunusi, Maimaitikasimu·Ubuliaishan, et al
　　(Department of Biochemistry, Preclinical Medicine College, Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China)
　　Abstact: ObjectiveTo establish theulcerative colitis (UC) animal model and using the method of metabonomic to discuss biomarker element of the UC. MethodsThe animals were divided into two groups at randomly, which was individually normal group (n=21) and model group (n=7), and establish the rat model by “DNCB+Acetic acid”, the plasma of two group's were collected and its 1H nuclear mannetic resonance (1HNMR) spectra were acquired. ResultsCompared with normal control group, model group′s valine, leucine, isoleucine, pyruvate, βhydrox ybutyrate, creatine, phenylalanine were reduced but very low density lipoprotein (VLDL) was hoist. Conclusion1NMRbased metabonomies approach shows that UC rats′ nutrients metabolize appears abnormity and valine, leucine, isoleucine, pyruvate, βhydroxybutyrate, creatine, phenylalanineietc maybe the biomarker element of the UC.
　　Key words: ulcerative colitis; metabonomic; biomarker element
　　溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因及发病机制不明确的肠道炎性疾病[1-2]。病变主要累及粘膜、粘膜下层，以溃疡、糜烂为主，多累及直肠和远端结肠，可以向近端扩展，以至遍及整个结肠[3]。临床以腹泻、腹痛、粘液脓血便和里急后重等为主要表现[4-5] ,该病好发于青壮年，往往反复发作，迁延不愈，近年来发病率日趋上升 [6-7]，被认为是结肠癌的癌前病变，已被世界卫生组织列为现代难治病之一[8]，并受到国内外医学界的普遍关注。代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础，代谢组是在代谢活动中产生的内源性代谢物质的动态整体。溃疡性结肠炎的发生、发展中伴随的病理生理紊乱会在代谢物成分中以新代谢产物出现或代谢产物之间相对浓度改变的形式得到体现[9-10]，因此，本研究应用代谢组学研究技术测试与比较正常对照组和模型组大鼠血浆中所包含的代谢产物,探讨溃疡性结肠炎相关的特异性标志物。
　　1　材料与方法
　　1.1　材料
　　1.1.1　实验动物健康的SPF级Wistar大鼠28只，雄性，体重220～250 g(新疆医科大学实验动物中心提供),随机分为正常对照组(7只)和溃疡性结肠炎模型组(21只)。
　　1.1.2　主要试剂及仪器设备
　　重水(D2O, Cambridge Iso tope Laboratories.Inc，美国);磷酸二氢钠、磷酸氢二钾均为国产,分析纯;Varian谱仪(美国制造，型号：INOVA 600)。
　　1.2　方法
　　1.2.1　取材采用2,4二硝基氯苯(2,4dinitrochlorobenzene，DNCB)复合乙酸法建立溃疡性结肠炎大鼠模型,在第20天对正常对照组大鼠和模型组大鼠隔夜禁食，次日以乙醚麻醉后，从眼球采血，迅速放入内有肝素的试管中，放入液氮罐中速冻后放入-80℃低温冰箱中保存至进行核磁共振检测。
　　1.2.2　1HNMR谱检测与分析
　　将血浆样品室温溶解，取血浆400 μl加入200 μl Buffer生理盐水溶液，高速恒温离心(4℃，时间10 min，转速度10 000 r/min)后，取上清液放入5 mm NMR样品管中，样品量均为0.55 ml。血浆的1HNMR谱图在新疆医科大学分析测试中心实验室进行检测，于25℃在Varian Unity INOVA 600型NMR谱仪上用CPMG自旋回波序列结合预饱和压水序列进行测试，回波时间为2 ms，32 768个数据点，累加128次，采样谱宽为10 000 Hz，以α葡萄糖(δH 5.233 ppm)为内标进行定标。数据采集后进行相位校正，基线校正。按默认范围(δ 9~0.5)ppm，每段为0.003 ppm进行分段并积分，同时排除以溶剂(D2O)峰为中心的部分(δ 4.67～5.2)ppm，将所产生的所有积分数据导入到Excel内并进行归一化处理。
　　1.2.3　主成分分析法(PCA分析法)所得到的数据文件利用simca
　　P软件包对1HNMR谱峰积分值进行PCA分析，得到PC图求出主成分(principal components，PC)，利用PC对各组大鼠血浆的代谢组进行分析。
　　2　结果
　　2.1　1HNMR谱分析
　　正常组与模型组大鼠之间1HNMR谱有明显差别，模型组大鼠的内源性代谢谱发生了明显的变化，见图1。
　　2.2　NMR图谱模式识别分析
　　PC积分值分别集中分布于椭圆形散点图(95%的置信区域内)的4个区域中，两组互相区分开，互不重叠，正常对照组和模型组的代谢表型有差异，见图2。
　　2.3　主要代谢物中1HNMR谱化学位移进行归属与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血浆中苯丙氨酸、丙酮酸、β羟丁酸、肌酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸含量明显降低，VLDL含量明显升高，差异有统计学意义(P 0.05)，见表1。表1正常对照组和模型组大鼠血浆中的差异性(略)
　　3　讨论
　　代谢组学(Metabonomics)是采用核磁共振、质谱等化学分析技术，分析生物体整体性代谢变化情况的一门新兴学科。机体的病理变化使得机体的代谢产物也发生相应变化，对疾病引起的代谢产物变化进行分析有助于疾病的发病机制阐述、疾病相关生物标志物的发现[11]。UC的发生过程也与体内代谢变化密切相关。本研究发现与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血浆中丙酮酸、β羟丁酸、肌酸、苯丙氨酸含量明显减少。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸为支链氨基酸(BCAA)，支链氨基酸是营养必需氨基酸，有促进蛋白质生物合成、抑制蛋白质分解代谢的作用[12];亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸分别是生糖氨基酸、生酮氨基酸和生糖兼酮氨基酸。BCAA也可作为氮源和碳骨架的供应者用于其它氨基酸的合成。研究表明，BCAA氧化产生三磷酸腺苷(ATP)的效率显著高于其他氨基酸，支链氨基酸通过转氨基作用生成相应的α酮酸(BCKA)，再经BCKA脱氢酶催化，进行不可逆的氧化脱羧，形成少一个碳原子的脂酰COA，进行β氧化，亮氨酸降解为乙酰乙酸和乙酰COA;异亮氨酸降解为丙酰COA和乙酰COA;缬氨酸降解为琥珀酰COA，再通过三羧酸循环产生能量[13]。因此，BCAA是重要的能量来源。本研究中模型组血浆BCAA含量明显降低，提示模型组大鼠体内糖、脂、蛋白质等三大营养物质及免疫功能发生紊乱，出现能量缺乏，并BCAA的降解可能作为能量的主要来源。丙酮酸(Pyruvate)是一种重要的α酮酸。它是糖酵解和糖有氧氧化途径的中间产物，组织细胞处于缺氧状态时，丙酮酸在胞浆中还原成乳酸;氧供充足时，丙酮酸进入线粒体内氧化生成乙酰辅酶A，并通过三羧酸循环进行氧化生成二氧化碳和水，完成葡萄糖的有氧氧化供能过程。因此，丙酮酸是糖代谢中具有关键作用的中间产物[14]。丙酮酸可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。研究表明，丙酮酸可作为一种抗氧化剂抑制鼠体内氧自由基的氧化作用。丙酮酸可直接通过非酶促的去碳酸基反应抑制过氧化氢，它可直接与氧自由基反应生成水和二氧化碳，并间接增加抗氧化剂即还原型谷胱甘肽的含量，进而增强谷胱甘肽抗氧化系统的功能[15]。本研究中模型组大鼠血浆中丙酮酸含量明显下降，提示溃疡性结肠炎发生时，丙酮酸可能作为一种过氧化氢清除剂，在防止自由基损伤肠粘膜过程中被大量消耗，导致血浆中丙酮酸含量下降。苯丙氨酸主要是在苯丙氨酸羟化酶的催化作用下羟化生成络氨酸，苯丙氨酸羟化酶属于一种加氧酶，辅酶是四氢生物蝶呤，催化的反应是不可逆的，故络氨酸不能转变为苯丙氨酸。络氨酸进行进一步代谢可生成多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素等儿茶酚胺类神经递质、激素及黑色素。苯丙氨酸和络氨酸作为生糖兼生酮氨基酸生成延胡索酸和乙酰乙酸后分别沿糖和脂肪代谢途径进行代谢[16]。本研究发现模型组大鼠血浆中苯丙氨酸含量下降，提示UC大鼠中三大营养物质代谢发生紊乱的同时存在神经内分泌系统功能异常。综上所述,UC大鼠血浆的代谢谱明显偏离正常大鼠，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙酮酸有可能作为溃疡性结肠炎早期诊断的分子标志物。
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