内容
作者：颜海,李文广,张燕妮,凌黎,李京微,姜海英,李艳芳 作者单位：1.徐州市肿瘤医院普外科,江苏徐州221005; 2.徐州市肿瘤医院肿瘤内科;3.徐州市肿瘤医院病理科
【摘要】 目的 探讨ezrin在乳腺癌组织、癌旁组织以及乳腺良性肿瘤中的表达及临床意义。方法 应用免疫组化S-P方法检测63例乳腺癌组织、20例乳腺癌旁组织及30例乳腺良性肿瘤中ezrin的表达情况。结果 ezrin在乳腺癌旁组织及乳腺良性肿瘤中均无异常表达;在浸润性乳腺癌组织中，ezrin的阳性表达率为55.56%(35/63)，并且ezrin阳性表达率随着临床分期的增高和淋巴结转移增多而升高(P 0.01)。无病生存(DFS)时间不足5年(远处转移)或5年内死亡患者的ezrin阳性表达率明显高于DFS在5年以上的患者(P 0.01)。ezrin的表达与年龄、肿瘤大小、月经无相关性(P值均 0.05)。结论 检测ezrin有助于对乳腺癌预后的判断，并且它可能成为一个新的乳腺癌治疗的靶点。
【关键词】 ezrin;乳腺癌;预后
The expression and the clinical significance of ezrin in breast cancer
YAN Hai1, LI Wenguang2, ZHANG Yanni2, LING Li3, LI Jingwei3, JIANG Haiying2, LI Yanfang2
(1. Department of General Surgery, Xuzhou Cancer Hospital, Xuzhou, Jiangsu 221005, China;
2. Department of Medical Oncology, Xuzhou Cancer Hospital;
3. Department of Pathology, Cancer Hospital of Xuzhou)
Abstract： Objective To discuss the expression and the clinical significance of ezrin in breast cancer, and to investigate its relationship with lymph node metastasis, clinical stages and prognosis. Methods Immunohistochemical streptavidin-perosidase (S-P) method was used to detect the expression of ezrin in 63 cases of breast cancer, 20 cases of corresponding cancer-adjacent tissues and 30 cases of benign tumor. The correlation of ezrin expression with relevant clinical data was analyzed. Results The ezrin expression rates in benign tumor and corresponding adjacent tissues were negative. In 63 cases of invasive breast cancer, the expression rate of ezrin was 55.56%, and the up-regulation of the ezrin expression was positively related with the progression of lymph node metastasis and clinical stages (P 0.01), while it was negatively correlated with the disease-free survival (DFS) of 5 years, as was demonstrated by the up-regulated expression rate in patients with DFS less than 5 years (distant metastasis) compared with those with DFS of 5 years and above (P 0.01). There was no evident correlation of ezrin expression with tumor size, age and menstruation status (P 0.05). Conclusion The determination of ezrin expressions contributes to the assessment of prognosis of breast cancer, and ezrin may further serve as a new therapeutic target in the treatment of breast cancer.
Key words：ezrin; breast cancer; prognosis
随着现代肿瘤治疗技术的不断进展，目前乳腺癌的治疗已经达到了一个很高的水平，其5年生存率达到80%以上。但是仍有一部分的乳腺癌患者预后不佳，很短的时间就会出现复发和转移，而且原因不明。ezrin是Yu等[1]和Khanna等[2]在2004年发现的一种与恶性肿瘤转移高度相关的蛋白。国外学者在黑色素瘤、骨肉瘤、肺癌以及乳腺癌中都发现了ezrin蛋白的表达，而且它的表达与肿瘤细胞的转移能力呈正相关。国内学者关于ezrin的研究集中在骨肉瘤和肝癌，而关于乳腺癌的研究鲜见报道。作者应用免疫组化的方法，研究了ezrin在乳腺癌组织以及乳腺良性肿瘤和癌旁组织中的表达情况，探讨ezrin与乳腺癌的复发以及临床预后的相关性。
1 资料和方法
1.1 资料 收集徐州市肿瘤医院1995年3月至2001年12月临床资料完整的63例乳腺癌(均为浸润性癌)病例，其中20例有癌旁乳腺组织。33例为无病生存(DFS) 5年(出现远处器官转移)或5年内死亡的患者(死亡与本病相关)，30例为DFS≥5年的病例。年龄28～78岁，中位年龄46.7岁。绝经前41例，绝经后22例。Ⅰ期8例，Ⅱ期21例，Ⅲ期31例，Ⅳ期3例。腋下淋巴结转移 4枚35例，≥4枚28例。所有患者术后都进行相应的化疗、放疗以及内分泌治疗，随访时间大于5年。30例乳腺良性肿瘤中有10例为我院2006年病例，其他病例为与乳腺癌同时期的病例。标本为5 μm厚制片供免疫组化染色。
1.2 试剂 ezrin单克隆抗体连霉亲和素-过氧化物酶(S-P)试剂盒、DBA试剂盒以及阳性对照片均购自福州迈新公司。一抗工作浓度为1∶100。
1.3 方法 采用S-P法。切片脱蜡至水，置入0.01 mmol/L枸椽酸盐修复液中，微波高温修复10 min。然后按照公司提供的标准方法进行操作，DBA显色，常规脱水、透明、封片。用公司提供的阳性对照片作为对照，PBS替代一抗为阴性对照。
1.4 结果判定 在光学显微镜下对染色情况进行评估，取5个高倍视野，各计数100个细胞。ezrin的评定参考Mathew等[3]分级标准：阴性，无表达;阳性， 50%细胞阳性表达或染色较浅;强阳性，≥50%细胞阳性表达且深染，称之为异常表达。1.5 统计学处理 采用SPSS 11.5统计分析软件对各指标结果进行χ2检验，P 0.05表示差异有显著性。
2 结 果
2.1 ezrin在乳腺癌中的表达及与临床因素之间的关系 ezrin阳性细胞主要表现为胞膜和胞质弥漫分布棕黄色颗粒，见图1。63例乳腺癌中ezrin阳性表达35例，占55.56%。Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌ezrin阳性表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ期( P 0.01);淋巴结转移≥4枚的患者ezrin阳性表达率显著高于淋巴结 4枚患者(P 0.01)。ezrin在肿瘤组织中的表达与患者年龄、月经状况以及肿块大小无明显相关性(P 0.05)，见表1。表1 ezrin蛋白表达与各临床因素之间的关系
2.2 ezrin在乳腺癌癌旁组织和良性肿瘤中的表达ezrin在乳腺癌癌旁组织和良性肿瘤组织均有表达，但都呈淡色，主要分布在腺导管上皮和腺泡上皮细胞膜，是一种生理性表达，与ezrin在乳腺癌中的表达相比有明显的不同，见图2，3。
2.3 ezrin表达和临床预后之间的关系 见表1。随着生存时间的延长，ezrin阳性表达率不断降低，无病生存时间≥5年的患者ezrin阳性表达率显著低于无病生存时间 5年或在5年内死亡的患者(P 0.01)。图2 ezrin在乳腺良性肿瘤中的表达(SP，×400)
3 讨 论
ezrin是细胞内一种具有重要生理作用的细胞骨架连接蛋白，参与细胞之间、细胞与基质之间的黏附、运动、信号的传导以及细胞分裂等各项活动。在2004年，Yu等[1]和Khanna等[2]在2个独立研究中发现，过表达的ezrin与恶性肿瘤的转移高度相关。
本研究对63例乳腺癌患者的临床资料进行回顾性分析，并应用免疫组化方法检测ezrin的表达，结果表明，淋巴结转移≥4枚的患者与淋巴结转移 4枚的患者相比，ezrin阳性表达率明显增高，并有显著性差异，这说明 ezrin在乳腺癌淋巴结转移过程中发挥重要作用。
Ezrin促进肿瘤转移的机制较为复杂，还未完全清楚。但已发现，它能从多个方面来促进肿瘤细胞的转移。一方面，它可以通过作用于细胞膜受体、影响肿瘤细胞连接以及调节细胞信号转导等促进肿瘤细胞的转移。另一方面，ezrin参与了E-cadherin等因子形成的能够调节细胞间以及细胞和基质相互黏附和连接的细胞复合体。Pujuguet等[4]发现过表达的ezrin可以阻止E-cadherin从细胞内向细胞膜的转运，细胞表面E-cadherin的减少使得依赖于它的细胞连接不能形成，造成了细胞间的松散[4-5]，促进了肿瘤细胞的转移。再一方面，过表达的ezrin可以作用于PI3-Kinase/AKT细胞信号传导途径。Khanna等[2]在研究骨肉瘤的转移时发现：高表达ezrin的肿瘤细胞在肺组织生存24～72 h后其瘤细胞的数量基本没有变化，而ezrin表达被抑制的瘤细胞在24 h以后就不能被检测到。这说明了ezrin通过PI3-Kinase/AKT信号传导通路阻止了瘤细胞的凋亡，促进了肿瘤细胞的转移。
本项研究还发现，ezrin蛋白的表达与临床分期和生存时间有相关性。ezrin表达高，易出现远处器官转移，预后差，这和国外的相关报道相似。5年内出现转移或死亡的患者，其ezrin蛋白的阳性表达率显著高于那些无病生存时间大于5年的患者(P 0.05)，说明ezrin表达在预测患者长期生存方面有重要意义。临床分期差(Ⅲ、Ⅳ期)即局部肿块大、淋巴结转移多或有远处器官转移的患者，ezrin蛋白的阳性表达明显升高，和早期(Ⅰ期、Ⅱ期)患者相比有显著性差异(P 0.01)。但原发肿瘤肿块大小与ezrin蛋白的表达无相关性(P 0.05)，这可能与ezrin蛋白的表达导致瘤细胞从瘤块不断脱落以及病例数少有关。另外，患者的年龄、月经情况与ezrin蛋白表达也无相关性(P 0.05)。总而言之，ezrin蛋白表达高的乳腺癌患者，易出现淋巴结和远处的转移，预后差。
Ezrin在生理机制下，具有重要的生理作用。ezrin的过表达，能抑制肿瘤细胞的凋亡，提高肿瘤细胞的转移能力。ezrin促进肿瘤转移的机制需要进一步的研究，但它对于鉴别乳腺肿块的良恶性以及指导乳腺癌的临床治疗方面具有重大意义。
【参考文献】
[1] Yu Y,Khan J,Khanna C,et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the development alhomeoprotein Six-1 as key metastatic regulators [J].Nat Med,2004,10(2):175-181.
[2] Khanna C,Wan X,Bose S,et al. The membrane-cytoskeleton linke ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis [J].Nat Med,2004,10(2):182-186.
[3] Mathew J,Hines JE,Obafunwa JO,et al. CD44 is expressed in hepatocellular carcinomas showing vascular invasion [J].J Pathol,1996,179(1):74-79.
[4] Pujuguet P, Del Maestro L, Gautreau A,et al. Ezrin regulates E-cadherin-dependent adherens junction assembly through Rac1 activation [J]. Mol Biol Cell，2003，14(5):2181-2191.
[5] Xu Y,Yu Q. E-cadherin negatively regulates CD44-hyaluronan interaction and CD44-mediated tumor invasion and branching morphogenesis [J]. J Biol Chem， 2003，278(10):8661-8668.