内容
作者：习峰敏，刘昌铭，李付名，浦周芳，刘赟心，赵文秀 作者单位：（吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013）
【摘要】 目的 比较三七根和茎叶中三七总皂苷含量。方法 以三七总皂苷回收率为指标，设计正交试验，优选硫酸铵/聚乙二醇双液相体系的最优萃取条件，在最优条件下用香草醛/高氯酸比色法分别测定三七根和茎叶中三七总皂苷的含量。结果 硫酸铵/聚乙二醇双液相最优萃取条件为聚乙二醇分子量6 000,聚乙二醇浓度24%，硫酸铵浓度12%，pH值2.5，有较高的分配系数7.45，回收率82.4%。此条件下测得三七根和茎叶中三七总皂苷含量分别为11.24%和12.98%。结论 三七茎叶在某些方面可作为三七根的替代资源，可为合理开发利用三七资源提供依据。
【关键词】 三七总皂苷；双液相体系；正交试验；含量测定
Determination of content of total saponins in Panpax Notoginseng roots and leaves by aqueous two phase system
XI Fengmin,LIU Changming,LI Fuming,PU Zhoufang,LIU Yunxin,ZHAO Wenxiu （School of Pharmacy,Jilin Medcial College,Jilin City,Jilin Province，132013,China）
Abstract:Objective To compare the content of total saponins in Panpax Notoginseng roots and leaves. Methods Recovery rate was used as indicator to design orthogonal experiment to optimize the extraction conditions of total saponins in aqueous twophase systems(ATPS) with polyethylene glycol(PEG) and ammonium sulfate.The content of total saponins in Panpax Notoginseng roots and leaves was detected by colorimetry with vanillin and perchlorate under the optimum extraction condition. Results The optimum extraction condition of ATPS was 24% PEG 6 000,12% (NH4)2SO4,pH 2.5 and maximum partition coefficient was 7.45.The recovery rate of total saponins in Panpax Notoginseng was 82.4%.The contents of of total saponins in Panpax Notoginseng in oots and leaves were 11.24% and 12.98%. Conclusion The Panpax Notoginseng leaves could be used as a substitutive resource of Panpax Notoginseng roots in some ways.The results could provide the basis for rational development and utilization of resources of Panax Notoginseng.
Key words:Panpax Notoginseng saponins;aqueous two phase system;orthogonal test;determination of content
三七(Panpax Notoginseng(Burk.)F.H.chen)为五加科人参属多年生草本植物，是传统的名贵中药材，主产于我国云南、广西。三七的干燥根，《本草纲目》中记载有散瘀止血、消肿定痛、补益气血等功效。大量研究证明，三七根对血液和造血系统、心脑血管系统、中枢神经系统、免疫系统等都具有显著的作用，其主要有效成分为总皂苷(total saponins of Panpax Notoginseng,PNS)、三七素等［1］。三七的干燥茎叶，含有与三七根类似的皂苷类有效成分，现代药理研究表明三七叶总皂苷具有明显的镇静、镇痛和消炎等作用，且其毒副作用小［2］。由于人们的传统习惯多以根入药，对三七茎叶资源综合利用研究很少，长期以来一直作为三七的副产品被废弃。初步统计，每年采收三七茎叶总产量大约2 500吨，仅有20%的茎叶资源被利用［3］。
双水相萃取技术(Aqueous twophase extraction,ATPS)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相，利用被分离物在两相中分配的不同而实现分离的技术。其特点是采用常温常压操作,设备要求低,萃取环境温和,易于放大和进行连续性操作［4］，目前国内已经有利用双水相体系萃取三七中三七总皂苷的研究报道［5］。本研究采用优化的双液相萃取技术从三七根及茎叶中提取总皂苷成分,利用香草醛/高氯酸比色法［6］测定三七根和茎叶中所含三七总皂苷含量并进行比较。实验萃取效果好，工艺简单，成本低，耗时少，为综合合理开发三七资源提供参考依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），PHSW系列微机型pH/mV计（上海理达仪器厂），800型电动离心机（金坛市富华仪器有限公司），HH601型超级恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司），FA1104N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 试剂
人参皂苷Rg1标准品（批号110703200726，中国药品生物制品鉴定所），PEG 2 000、PEG 4 000和PEG 6 000（北京索莱宝科技有限公司），三七块根和三七叶购自云南文山县，硫酸铵、高氯酸、冰乙酸和甲醇均为分析纯，香草醛为化学纯。
2 方法和结果
2.1 标准品溶液的配制
精密称取5 mg人参皂苷Rg1标准品，加甲醇定容至5 mL，配成1 mg/mL溶液。
2.2 供试品溶液的制备
称取1 g三七粉末于烧瓶中，加入100 mL蒸馏水，100 ℃热浸60 min后过滤，滤渣用少量热水洗涤，滤液加热浓缩至30 mL即得浓缩液，冷却低温保存备用。
2.3 最大吸收波长的确定
精密吸取标准品溶液150 μL于试管中,甲醇溶液作空白对照，置水浴上挥去溶剂,加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,在60 ℃水浴中加热15 min，流水冷却,加冰醋酸5 mL,摇匀,放置15 min,在波长400～700 nm范围内扫描，得吸收光谱。结果在553 nm处有最大吸收，故选择553 nm为测定波长。
2.4 标准曲线绘制
分别精密吸取上述标准品溶液30、60、90、120、150、180 μL于试管中,甲醇溶液作空白对照，置水浴上挥去溶剂，按最大吸收波长测定方法操作至放置15 min，在553 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，可知人参皂苷Rg1含量在5～30 μg/mL范围内,能够保持良好的线性关系（r2=0.999 5），回归方程A=0.030 7C-0.059 44。
2.5 双液相萃取实验方法和正交试验
对影响聚乙二醇/硫酸铵双液相萃取体系的四个主要因素：PEG分子量、PEG浓度、硫酸铵浓度和pH值，设计L18(34)正交试验（各因素水平见表1），以三七总皂苷回收率为指标，优选最佳萃取条件。实验方法如下：常温下，取0.5mL三七块根浓缩液于10 mL刻度离心试管中，按因素水平表（表1）表1 因素水平表（略）和正交试验表（表2）表2 正交试验结果（略）加入一定比例的聚乙二醇和硫酸铵萃取液6 mL，调节至相应的pH；在离心机中以2 000 r/min的转速离心5 min，使其分相；分别读取上下层体积，然后各取上下层100 μL液体按最大吸收波长步骤测量吸光度。根据标准曲线方程计算各相中三七总皂苷的浓度，皂苷的回收率按下式计算：
Y=RK/(1+RK)×100%
其中相比R=V1/V2
分配系数K=C1/C2
V1、V2分别是上下层体积(mL)
C1、C2分别是上下层三七总皂苷的质量浓度(mg/mL)
由正交试验结果可知，影响因素A B C D，表明PEG分子量对回收率影响最大，PEG浓度影响较大，硫酸铵浓度影响较小，pH影响最小。确定最优萃取条件为A3B3C1D1，即PEG分子量为6 000，PEG浓度24%，硫酸铵浓度12%，pH 2.5作为萃取三七总皂苷的最优条件。
2.6 稳定性考察
取供试品溶液1份0.5 mL，按测最大吸收波长方法操作，分别在第15 min、20 min、30 min、45 min和60 min测定吸收度。计算三七总皂苷浓度RSD为2.29%，说明在1 h内测定的数据基本稳定，选择测定时间为15 min可以满足测定的要求。
2.7 精密度实验
取供试品溶液1份0.5 mL，按双液相萃取操作方法，离心分层后，准确吸取100 μL上层待测液6份,按最大吸收波长分析方法测吸光度。结果浓度RSD为1.84%，表明其重现性较好。
2.8 加标回收率实验
精密吸取100 μL上层三七总皂苷含量已知的样品6份,分别加入对照品溶液58 μL,按最大吸收波长分析方法测吸光度。结果见表3，表 3 样品的回收率（略）计算平均回收率为99.42%，RSD为1.18%。
2.9 样品含量测定
取三七根和茎叶样品各3份，在最优萃取条件下按测最大吸收波长步骤测量吸光度值。计算得三七根和茎叶中三七总皂苷含量分别为11.24%和12.98%（见表4），表 4 三七根和茎叶中三七总皂苷含量(%)（略）可知三七茎叶中三七总皂苷含量比根中略高。
3 讨论
以选定的聚乙二醇/硫酸铵构成的双液相体系用于三七总皂苷的分离,操作简便,分离效果好,三七总皂苷的分配系数大。在聚乙二醇分子量为6 000，聚乙二醇浓度24%，硫酸铵浓度12%，pH 2.5作为萃取三七总皂苷的最优条件，三七总皂苷分配系数达7.2，回收率达82%以上。方法学考察说明，该法是一种简便、准确、有效的三七总皂苷的含量分析方法。
三七总皂苷在三七根和茎叶中分布不同，分别为11.24%和12.98%，且三七茎叶中含量比根中略高。在某些方面，三七茎叶可作为三七根资源的替代物，缓解三七资源供需求紧张。应积极开发利用三七茎叶资源，结合三七茎叶化学成分和药理作用，加大三七茎叶的开发力度，三七茎叶产品将产生更大的经济和社会效益，这对于我国三七植物资源的可持续发展及三七产业价值提升，都将起到积极的推动作用。
【参考文献】
［1］杨志刚,陈阿琴,俞颂东.三七药理研究新进展［J］.上海中医药杂志，2005，39（4）：5961.
［2］雷伟亚,史栓桃,余思畅.三七叶总皂苷的毒性研究［J］.药物研究，1984，5（4）：241242.
［3］周家明,崔秀明,曾鸿超,等.三七茎叶的综合开发利用［J］.现代中药研究与实践,2009,23(3):3234.
［4］辜鹏,谢放华,黄海艳,等.双水相萃取技术的研究现状与应用［J］.化工技术与开发，2007，36（11）：2932.
［5］谢涛,廖安平,易元龙,等.双水相萃取三七中三七皂苷的研究［J］.中药材，2008，31（4）：535537.
［6］吴少雄,王保兴,郭祀远,等.三七叶苷的提取分离与纯化［J］.食品与发酵工业,2005,31(1):149150.