内容
作者：欧阳伟炜， 解用江， 唐劲天 作者单位：1.贵州省肿瘤医院胸部肿瘤科， 贵州 贵阳 550004; 2.黑龙江省大庆油田总医院口腔科， 黑龙江 大庆 163001; 3.清华大学工程物理系医学物理与工程研究所， 北京 100084
【摘要】 目的： 评估热籽对荷瘤大鼠肿瘤加温治疗的杀伤效果。方法： 将接种Walker-256肿瘤细胞的Wistar大鼠随机分为5组，C组（空白对照组）、M组（磁场对照组）、T组（热籽对照组）、H组（加温治疗H1组，H2组），H1组：瘤内植入2颗居里点57℃热籽，持续30 min；H2组：2颗居里点70℃热籽，持续6 min。在加温治疗后即刻及24 h取H组及C组肿瘤组织行组织学及免疫组化检查。治疗后9 d测5组肿瘤体积及质量。结果： 加热后热籽周围肿瘤组织呈现凝固性坏死，热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)70表达较C组增加，24 h后表达明显减少。热疗后肿瘤体积H1组、H2组与C组、M组之间差异显著（P＜0.05），肿瘤质量H1组、H2组与C组差异显著（P＜0.05）。结论： 热籽加温治疗对荷瘤大鼠肿瘤生长有一定的抑制作用。
【关键词】 热籽； 热疗； 肿瘤； 温度； 时间
The Curative Effect of Thermo-seed Induced Heating On Tumor-Bearing Rats
OUYANG Weiwei1, XIE Yongjiang2, TANG Jintian3
(1. Department of Thoracic Oncology, Guizhou Cancer Hospital, Guiyang, 550004, China; 2. Department of Stomatology,
Daqing oil field general hospital, Daqing, 163001, Heilongjiang, China; 3. Institute of Medical Physics and
Engineering, Department of Engineering Physics, Tsinghua University, Beijing, 100084, China)
［Abstract］ Objective: To evaluate the killing effect of thermoseed inductive heating on implanted tumor in rats. Methods: Wistar rats with tumor Walker-256 were divided into five groups, including group C (blank control group), group M (magnetic control group), group T (thermoseeds control group) and heating treatment groups, group H1 and group H2. In group H1, two thermoseeds with 57℃ curie point were implanted into tumor tissues of each rat with a heating time of 30 minutes. For group H2, two thermoseeds with 70℃ curie point were implanted into tumor tissues of each rat with a heating time of 6 minutes. Histological and immunohistochemistry observations on tumors were carried out in groups H1, H2 and C immediately and in 24 hours after the heating treatment.Tumor volumes and weights were measured in five groups in 9 days after the treatment. Results: Tumor tissues around thermoseeds array showed coagulation necrosis after heating. Heat shock protein 70 expression was stronger in group H1 and group H2 than in group C, while the expression decreased in 24 hours later. After the treatment for days, the tumor volumes in groups H1 and H2 were significantly smaller than those in groups C and M (P＜0.05）, and tumors in groups H1 and H2 were significantly lighter than those in group C（P＜0.05）. Conclusions: Thermoseeds induced heating could inhibit tumor growth in rats.
［Key words］ thermoseed; thermotherapy; neoplasms; rats, Wistar; treatment outcome
肿瘤热疗是近年来发展较快的一种治疗方法，传统的热疗方法有射频、微波和超声治疗等，但这些方法都有一些不足。热籽感应加温治疗是由射频感应加温技术发展而来，它是通过经皮穿刺或术中植入等方法使热籽适形分布于肿瘤组织，在交变磁场中产生治疗所需要的温度。热籽具有的自控温，内加热，可从复等特点使其在肿瘤的加温治疗中具有较好的应用前景[1]。本文通过热籽感应加温治疗皮下接种Walker-256肿瘤细胞的Wistar大鼠的病理组织变化及分组加热实验来探讨治疗效果。
1 材料与方法
1．1 主要材料与设备 热籽：为镍-铜合金，直径0.9 mm，长约1.1 cm，与北京科技大学金属物理研究室合作研制。仪器：磁感应热疗机（磁感应强度400 Gs，频率40 kHz，电流50 A）：清华大学。测温探头为It-18型铜-康铜热电偶，直径1 mm，温度响应时间0.1 s，由美国Physitemp 公司制造。温度显示装置为四通道数显仪，型号XS01A-4，北京昆仑天辰仪表科技有限公司制造。电子天平由梅特勒－托利多仪器上海有限公司提供。游标卡尺购自哈尔滨量具刃具集团有限责任公司。DL-CJ-1N高性能无菌实验台，购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公司。3-18K恒温离心机购自Sigma公司。Walker-256肿瘤细胞由中国医学科学院协和医科大学药物研究所提供。Wistar大鼠（雄性180～220g）由中国医学科学院动物中心提供。RPMI1640培养基自行配制，热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP) HSP70购自武汉博士德生物工程有限公司。
1．2 肿瘤动物模型建立：
1．2．1 Walker-256肿瘤细胞先复苏后离心1 200 r/min，7 min，弃上清液，后在RPMI1640培养基中清洗2次。取细胞悬浮液1 ml注入Wistar大鼠腹腔，1周后大鼠腹腔长满腹水。
1．2．2 肿瘤接种 抽取大鼠癌性腹水，放入离心管中，离心1 200 r/min，7 min后弃上清液，加入RPMI1640培养基清洗，离心1 200 r/min，7 min，再弃上清液。以生理盐水稀释，细胞计数，调整细胞浓度至2×106/ml。在大鼠右侧腋下各注入细胞悬液0.2 ml，10日后大鼠皮下长出直径约1.5 cm肿瘤，随机分组，开始实验。
1．3 实验动物分组 全部45只荷瘤大鼠随机分为5组，C 组（空白对照组）、M组（磁场对照组）、T 组（热籽对照组）、H 组（加温治疗H1组，H2组），进行以下实验。
1．3．1 热疗后肿瘤组织病理学及免疫组织化学检查
共10只大鼠，H组8只，按不同加温情况分为H1组及H2组，每组4只。H1组分别在每只大鼠瘤内平行植入2颗居里点为57℃热籽，间隔0.5 cm，进行加热，温度达到43～47℃，持续30 min；H2组分别在每只大鼠瘤内植入2颗居里点为70℃热籽，间隔0.5 cm，进行加热，温度达到52～56℃，持续6 min。热疗后即刻处死4只大鼠，每组2只,24 h后再处死另外4只大鼠。同时设C 组2只大鼠对照。上述处死大鼠行肿瘤组织病理学及免疫组织化学检查。
1．3．2 分组加温热疗实验
共35只大鼠，分成5组，每组7只。C组：对荷瘤大鼠不做任何处理；M组：将荷瘤大鼠在同样磁场中放置30 min；T组：仅在大鼠瘤体内植入2 颗间隔0.5 cm的热籽，不进入磁场加温；H组：瘤体内平行植入2颗居里点相同的热籽后放入磁场加温，分为上述H1和H2两个亚组。用游标卡尺测量每只大鼠肿瘤体积，每3天测量1次。测出最大直径（a）和垂直方向最大直径（b），肿瘤体积计算公式：V＝（a×b2）/2。加热9 d后，处死大鼠，取其肿瘤组织电子天平称取其质量。
1．4 热籽植入及感应加温治疗
热籽植入完成后，进行X 线拍照，验证热籽植入后和测温探头的位置。需要进入磁场的大鼠分别腹腔注射2％戊巴比妥钠2.3 ml/kg麻醉后，置入交变磁场中。其中M组大鼠置于交变磁场中30 min， H1组和H2组大鼠使植入的热籽长轴方向与交变磁场方向平行，用连于四通道数显仪的3根热电偶分别监测大鼠肿瘤中心、肿瘤边缘正常组织及大鼠体温（肛温）温度的变化，加热电流固定在50 A。H1和H2组在测温2 min后，开始加热。加热时间分别为30 min和6 min。
1．5 数据处理与统计学分析
计量资料以均数±标准差表示，P＜0.05为有统计学意义，数据分析采用Excel软件及SPSS11.0统计软件分析。
2 实验结果
2．1 热籽在大鼠肿瘤内加热时温度监测肿瘤中心，肿瘤边缘，大鼠肛门温度进行监测。
tumor-bearing rats in group H2 钟时达到46℃，之后便逐步达到平台期，保持在46～47℃附近直至加温结束；肿瘤边缘正常组织温度则上升较慢，加温结束时可达到40.8℃，在整个加温过程中大鼠的肛门温度变化不大，始终保持在38～39℃左右。H2组加温前大鼠的起始温度在37℃左右。肿瘤中心位置加热3 min 后达到55.1℃，之后达到平台期，保持在55～56℃直至加温结束；肿瘤边缘温度上升较慢，加温结束时可达到41℃；大鼠的肛门温度变化不大,在37.5～39.3℃。见图1、2。
2．2 热疗后肿瘤组织病理学及免疫组织化学变化
热疗后H1组肿瘤组织及H2组肿瘤组织切片可见肿瘤组织加热后，热籽植入位置附近肿瘤组织大片凝固性坏死，镜下表现为呈嗜酸性增强，细胞结构消失，核碎裂、溶解，大量细胞碎片形成，也有部分肿瘤细胞表现为核固缩，染色质边聚、浓缩等凋亡的形态学改变。可见少数肿瘤细胞残存。见图3A、B。
免疫组织化学染色见空白对照组肿瘤细胞胞浆HSP70表达，加温治疗组57℃及70℃热籽治疗后HSP70的表达进一步增加。57℃热籽加热治疗24 h后大多数肿瘤细胞出现凋亡及坏死，残存的少许肿瘤细胞胞浆HSP70表达，70℃热籽加热治疗24 h后HSP70不表达。见图4A-E。
2．3 热疗对肿瘤的影响
5组大鼠用于观察磁感应热疗的效果，其中C组有2只大鼠因为肿瘤体积较大于处理后第8 d、第9 d死亡。M组和T组各有1只大鼠因为肿瘤体积较大于处理后第8 d死亡。H1组有1只大鼠肿瘤完全消退，消退率为14.29%。H2组有3只大鼠肿瘤完全消退，消退率为42.86%。C组、M组和T组肿瘤体积均逐渐增大。
各组大鼠肿瘤热疗后体积及质量见表1，可见热疗后肿瘤体积H1组、H2组与C组、M组之间比较差异显著（P＜0.05），H1组、H2组与T组比较差异不显著（P＞0.05）。肿瘤质量在H1组、H2组与C组比较差异显著（P＜0.05）。肿瘤体积和质量在C组、M组和T组3个对照组之间比较差异不显著（P＞0.05）。肿瘤体积和质量在H1组与H2组比较差异不显著（P＞0.05）。表1 5组大鼠肿瘤体积、质量的比较 H1组、H2组与C组、M组肿瘤体积比较均P＜0.05；(1)与C组比较P＜0.05；(2)与C组比较P＜0.05；肿瘤体积及质量在C组、M组和T组组间比较均P＞0.05；肿瘤体积和质量H1组与H2组比较P＞0.05。
3 讨论
热籽材料是一种特殊的合金，由非磁性材料和磁性金属组成。这种合金的特点是可以限制其最高温度，即居里点现象。将热籽置于交变磁场中感应加热，当其温度升高并达到居里点时，热籽便失去磁性而导致加热升温能力急剧下降；当温度下降到居里点以下时，热籽又具有磁性而恢复加热能力，并最终使要加热的区域达到同热籽居里点相近的温度(但这必须是热籽的产热大于周围组织热量的散失)，因而达到自动控温的目的[1]。热籽由于其居里点自动控温这一特性，减少了对侵入性测温的要求；可以避免组织被烧焦和炭化，提高了治疗的安全性；植入热籽可以在影像学指导下进行，因而可以避免开放性手术实现微创治疗。热籽感应加温治疗已经在动物实验和临床前期试验中显示出了良好的应用前景[2,3,4,5,6]。
细胞在42～45℃时主要死亡方式是凋亡，当温度升高到45℃以上时，坏死细胞数量迅速增加[7]。反映热剂量生物学效应的基本物理量是温度和时间。热剂量与时间、温度的Arrhenius等效关系：温度升高1℃，杀灭癌细胞所需的时间成倍的减少。为了将加热效应控制在同一水平，在43℃以上时，温度每降低1℃，加热时间需增加1倍；在43℃以下时，温度每降低1℃，加热时间需增加3~4倍。这说明加热温度和时间两个热剂量因子中，温度更具有决定意义。本实验中H2组的温度较高其肿瘤消退率较H1组好，但与H1组比较无显著性差异，这需要增加大鼠样本进一步研究。加温治疗组的肿瘤体积和质量明显的较空白对照组小，差异有统计学意义，这反映了热疗对肿瘤有一定的杀伤作用。熊国欣等[8]将直径1 mm，居里点为60℃的镍-铜热籽植入昆明种小鼠S180肉瘤内，在180 kHz，6 mT的交变磁场中加热，也显示了较好的治疗效果。
热休克蛋白按分子量大小分为以下几个家族：小分子HSP（相对分子质量为22～32ku）、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110和泛素（相对分子质量为7～8 ku），其中最重要、诱导后表达量最大的是HSP70家族。HSP70是热休克蛋白家族中最重要的成员之一，它具有“分子伴侣”功能，参与蛋白质合成、加工、折叠、转运等过程。它在肿瘤细胞特别是在恶性肿瘤细胞中常有高水平表达，可以通过基因调节及免疫应答来发挥抗肿瘤细胞凋亡作用。本实验中观察发现HSP70在热籽诱导加热治疗后表达进一步增加，24 h后因为肿瘤细胞的大量坏死表达量明显降低。HSP70的表达对细胞有保护作用但同时其可以激活机体特异的肿瘤免疫反应抑制肿瘤的增殖[9]。
总之，热籽感应加温治疗对大鼠肿瘤生长有一定的抑制作用，其能适形分布于肿瘤组织内导致肿瘤细胞的凋亡及坏死。热籽加温治疗后可以诱导HSP70的表达，其表达量在24 h后明显降低。
【参考文献】
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