内容
作者：陈登宇， 刘 芸， 钟田雨， 王 蔚， 赵明哲， 刘靖华， 姜 勇 作者单位：南方医科大学 病理生理学教研室，广东省功能蛋白质组学重点实验室， 广东 广州 510515
【摘要】 目的： 构建BNIP3-HA融合蛋白的真核表达载体，观察BNIP3在Hela细胞中表达及其定位。方法： 采用两步克隆法将HA和BNIP3的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上，随后转染Hela细胞。BNIP3经AlexaFluor 488免疫荧光标记，线粒体用MitoFluor Red 589染色后在荧光显微镜下观察BNIP3的表达和定位。结果： 重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR) 和测序鉴定构建正确，并在Hela细胞中能够表达，在荧光显微镜下观察，BNIP3-HA融合蛋白分布于线粒体。结论： 成功构建BNIP3-HA融合蛋白表达载体并在Hela细胞线粒体中表达。
【关键词】 基因，bcl-2； Hela细胞； 线粒体； 荧光免疫测定； 细胞内定位
Human BNIP3 Gene Expression and Its
Intracellular Localization in Hela Cells
CHEN Dengyu, LIU Yun, ZHONG Tianyu, WANG Wei, ZHAO Mingzhe, LIU Jinghua， JIANG Yong
(Department of Pathophysiology and KeyLaboratory of Functional Proteomics of Guangdong
Province, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China)
［Abstract］ Objective: To construct human BNIP3 fuse protein vector, express it in Hela cells, and determine its location in the cells. Methods: The expression vector was constructed by cloning the coding sequences of fusion protein of human BNIP3 and HA onto vector pcDNA3 by two-step method; The constructed vector was then transfected into Hela cells and observed with fluorescence microscope. The recombinant plasmid was verified by enzyme digestion, polymerase chain reaction (PCR) and sequence analysis. Results: The fusion protein was highly expressed in Hela cells. Being observed with fluorescence microscopy, the fusion protein of human BNIP3 and HA was found to distribute in the mitochondria. Conclusion: The expression vector of BNIP3 fusing to HA is successfully constructed and the fusion protein has expressed in the mitochondria of Hela cells, which would facilitate the further study of BNIP3.
［Key words］ genes,bcl-2; hela cells; mitochondria; fluoroimmunoassay; intracellular localization
BNIP3作为bcl-2家族中促凋亡成员，在肿瘤的缺氧凋亡和免疫耐受的研究中有着非常重要的意义[1]。以往的研究发现，BNIP3促进细胞凋亡主要是通过线粒体凋亡途径完成的。但BNIP3的线粒体膜转位及其促细胞凋亡机制尚不清楚[1]。构建带有HA标签的BNIP3真核表达载体，并通过细胞免疫荧光技术观察了该蛋白在人Hela细胞线粒体中的定位情况，试图为探讨BNIP3蛋白在不同细胞类型中的表达和亚细胞定位，及其与线粒体内其他蛋白质的相互作用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要材料
克隆载体pcDNA3购自Clontech公司；大肠杆菌DH5α及人Hela细胞系均为本室保存；PolyFect 转染试剂购自Qiagen公司; 小鼠HA单克隆抗体购自Cell Signaling公司；羊抗鼠IgG（H+L）AlexaFluor488、MitoFluor Red 589和DAPI细胞核染色试剂购自Molecular Probes公司；DMEM培养基购自Gibco-BRL公司; 胎牛血清（FBS） 购自HyClone 公司; 微量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自U-gene 公司; 限制性核酸内切酶Kpn I、EcoR I、Xba I、BamH I、Ligation high试剂、高保真DNA 聚合酶Kodplus和Kodplus突变试剂盒购自ToYoBo公司; 引物由北京英骏公司合成；1 kb、500 bp DNA Marker 购自NEB公司；琼脂糖和LB培养基购自Life Technology公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 pcDNA3-BNIP3-HA 融合蛋白真核表达载体的构建
构建流程见图1。设计分别含有HA序列片段的上下游引物,将HA编码序列插入质粒pcDNA3的多克隆位点中的Xba I和Apa I之间，上游引物为5′ccagattacgcttaagggccctattctatagtgtcacc 3′,下游引物为5′aacatcgtatgggta tctagatgcatgctcgagcg 3′。以高保真DNA 聚合酶KOD plus 进行反向聚合酶链反应(PCR )。反应条件: 94 ℃、2 min, 98 ℃、10 s, 55 ℃、30 s，68 ℃、5 min 30 s, 10 个循环。PCR 产物直接进行Dpn I酶切反应1 h, 产物使用T4DNA连接酶和Ligation high 16 ℃过夜连接,反应产物转化氯化钙制备的新鲜DH5α感受态菌并接种到含有氨苄青霉素的Luria Bertani(LB) 琼脂培养板, 37 ℃ CO2 孵箱培养12 h。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB 培养基中, 37 ℃振摇过夜。小量提取质粒, 分别进行测序鉴定。构建质粒命名为pcDNA3-HA。
设计分别含EcoR I 和Xba I 酶切位点的上下游引物, 从载体pDEST22-BNIP3载体上扩增BNIP3编码序列, 上游引物为5′cggaattcacccagaccctcaagtacgcctccagag 3′, 下游引物为5′gc tctaga tctgtccaaaaactgtaggttgatgctcctttc 3′,以高保真DNA聚合酶KODplus进行PCR , 反应条件: 94 ℃、15 s, 55 ℃、30 s，68 ℃、2 min, 35 个循环。用EcoR I和Xba I核酸内切酶分别对PCR 产物及载体质粒pcDNA3-HA 进行双酶切。酶切产物凝胶电泳分离并回收,T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接。连接产物转化DH5α感受态菌并接种到含有氨苄青霉素的LB 琼脂培养板,37 ℃ CO2 孵箱培养12 h。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB 培养基中,37 ℃振摇过夜。小量提取质粒, 分别进行PCR、EcoR I和Xba I酶切及测序鉴定。构建质粒命名为pcDNA 3-BNIP3- HA。
1.3 脂质体介导的瞬时转染和表达
Hela 细胞培养于含有体积分数为10% FBS、0.1 mmol/L 非必需氨基酸的DMEM 中, 置于体积分数为5%的CO2培养箱, 37 ℃培养。转染前24 h按6×104个细胞将细胞传代铺于petri皿中。待细胞长至约40%~50% 融合时, 按照polyfect转染试剂盒说明进行转染，先将300 ng 质粒DNA用无血清培养基稀释至终体积20 μl并混匀, 取3 μl PolyFect加入DNA中, 温和混匀, 于室温下孵育10 min。期间给细胞置换新鲜的含有10% FBS的DMEM。在DNA转染复合物中加入120 μl 含10% FBS的培养基, 轻柔混匀并均匀滴入petri皿中,然后将细胞置于5%CO2培养箱中37 ℃继续培养48 h。
1.4 细胞固定、染色观察及照像
观察前, 去除细胞培养上清, PBS洗涤1 次, 以体积分数为4% 的多聚甲醛固定细胞10 min; PBS洗涤3次, 以体积分数为0.1%的PBST处理细胞5 min，PBS洗涤3次，以质量分数为0.1%的硼氢化钠(NaBH4) 处理细胞5 min; PBS 洗涤3次,3%BSA室温封闭1 h，0.1%的PBST洗涤3次，小鼠HA单克隆抗体为一抗，室温孵育1 h，0.1%的PBST洗涤3次，羊抗鼠IgG（H+L）AlexaFluor488为二抗，室温孵育1 h，0.1%的PBST洗涤3次，再以100 μl 的DAPI细胞核染色试剂染核5 min。PBS洗涤细胞,以500 nmol/L的MitoFluor Red 589 线粒体染料100 μl于37 ℃孵育15 min，PBS洗涤3次，于倒置荧光显微镜下观察结果并照像。
2 结果
2.1 构建载体鉴定
2.1.1 构建质粒pcDNA3-HA鉴定 见图2。DNA测序结果显示, HA片段插入位置正确，重组pcDNA3-HA 质粒构建正确。
图2 构建载体测序鉴定
Fig.2 Identification of vectors by sequencing
2.1.2 构建质粒pcDNA 3-BNIP3- HA鉴定 见图3。PCR 扩增产物电泳可见到特异的约579 bp DNA片段,与插入的DNA 序列大小相符。EcoR I和Xba I双酶切鉴定产物电泳可见514 kb和579 bp 2个条带,一条与pcDNA3-HA原质粒EcoR I和Xba I双酶切产物电泳结果一致,另一条与PCR 产物大小一致。并经DNA测序结果显示,重组pcDNA 3-BNIP3- HA质粒构建正确。
2.2 BNIP3- HA 融合基因在Hela细胞内的表达见图4。pcDNA3-HA转染的对照组Hela细胞无绿色荧光分布；用0.3 mg 重组pcDNA3-BNIP3-HA 转染Hela细胞后48 h绿色荧光布于线粒体中，线粒体为红色荧光分布，融合颜色为黄色。
3 讨论
人BNIP3基因全长为1 535 bp，位于10q26.3，开放阅读框编码1个含194个氨基酸的蛋白质，分子量为21.54 kD[2]。Northern杂交发现，BNIP3在心、肝、脑、肾、胰和骨骼肌等多种正常成人组织中均有表达[2]。细胞定位研究发现该蛋白在一些真核细胞中表达后可以定位于线粒体外膜、内质网膜和核膜。内源性BNIP3松散地联结于正常组织的线粒体外膜。当BNIP3过表达时，以N末端位于胞浆和C末端位于膜内的方式完全整合入线粒体外膜，通过开放MPTP和损伤线粒体功能导致细胞死亡[1]。
内源性BNIP3如何保持非激活和非整合状态，内源性BNIP3的线粒体膜转位是否和其他的bcl-2家族促凋亡成员一样是通过磷酸化、二聚体
注：A是BNIP3-HA蛋白分布; B是线粒体染色荧光结果；C是DAPI染核结果；D是 A B C三者叠加结果形成或蛋白裂解酶裂解等翻译后修饰机制实现的还需进一步研究。近几年研究结果表明，BNIP3的异常表达与许多肿瘤的进展及耐药机制关系密切，大部分肿瘤中BNIP3的活性与相应正常组织相比是下调的，这有助于肿瘤细胞逃避缺氧诱导的细胞死亡而存活，促进肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的机制之一，许多化疗药物就是通过促进BNIP3表达，诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗目的[3~6]。肿瘤细胞中BNIP3表达下调使凋亡减少，降低了化疗药物的细胞毒性，可能是导致肿瘤耐药的机制之一[7]。这些相关机制的研究是该蛋白最近研究的热点之一。
在本文中，将分子标签HA的编码序列重组到BNIP3的3’末端，构建了HA标签的真核表达载体pcDNA3-BNIP3-HA。并研究了BNIP3-HA融合蛋白在人的Hela细胞内的表达定位情况，通过线粒体染料的共定位发现，蛋白BNIP3表达并定位于线粒体。
【参考文献】
[1]谢晋予,郑长黎.BNIP3基因及其与肿瘤的关系[J].国际病理科学与临床杂志,2006(8)：298-301.
[2]YasudaM, Theodorakis P, Subramanian T, et al. Adenovirus E1B19K/BCL-2 interacting protein BNIP3 contains a BH3 domain and a mitochondrial targeting sequence[J]. J Biol Chem, 1998(20):12415-12421.
[3]Guo K, Searfoss G, Krolikowski D, et al. Hypoxia induces the expression of the pro-apoptotic gene BNIP3[J].Cell Death Differ,2001(4):367-376.
[4]Yook YH, Kang KH, Maeng O, et al. Nitric oxide induces BNIP3 expression that causes cell death in macrophages[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004(2):298-305.
[5]Burton TR, Henson ES, Baijal P, et al. The pro-cell death Bcl-2 family member, BNIP3, is localized to the nucleus of human glial cells: Implications for glioblastomamultiforme tumor cell survival under hypoxia[J]. Int J Cancer, 2006(7):1660-1669.
[6]Giatromanolaki A, KoukourakisMI, Sowter HM, et al. BNIP3 expression is linked with hypoxia regulated protein expression and with poor prognosis in non-small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res,2004(16):5566-5571.
[7]Akada M, Crnogorac-Jurcevic T, Lattimore S, et al. Intrinsic chemoresistance to gemcitabine is associated with decreased expression of BNIP3 in pancreatic cancer[J].Clin Cancer Res, 2005(8):3094-3101