内容
作者：刘嘉， 崔 明， 王世清 作者单位：成都军区昆明总医院 普通外科， 云南 昆明 650032
【摘要】 目的： 探讨ALA-PDT后结肠癌细胞关卡相关因子P21、P27、cyclinE、CDK2 mRNA的表达情况。方法： 应用RT-PCR技术对ALA-PDT后结肠癌细胞株SW480 P21、P27、cyclinE、CDK2 mRNA的含量进行检测。结果： ALA-PDT后P21 mRNA含量较PDT前明显提高（P 0.01），而cyclinE、CDK2 mRNA的含量下降（P 0.01）, P27 mRNA含量无明显改变。结论: ALA-PDT对肿瘤细胞的增殖抑制作用可能与其诱导P21 mRNA的过表达，进而下调cyclinE、CDK2的表达有关。
【关键词】 结肠肿瘤； 细胞周期； 光动力疗法; 增殖抑制
The Proliferation Inhibitory Effects of Photodynamic Therapy
on the Cell Cycle of Colon Carcinoma
LIU Jia, CUI Ming, WAN Shiqing
(Department of General Surgery, Kunming General Hospital, Chengdu Military Distric, Kunming 650032, Yunnan, China)
［Abstract］ Objective: To study the expression of correlation factors of P21, P27, cyclinE, and CDK2 in colon carcinoma SW480 cells after the treatment of 5-aminolevulinate acid photodynamic therapy (ALA-PDT). Methods: The expression of P21, P27, cyclinE, and CDK2 in colon carcinoma cell line (SW480 cells) were detected by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique after the cells were treated with ALA-PDT. Results: The expression of P21 increased (P 0.01) while the mRNA contents of cyclinE and CDK2 decreased (P 0.01) remarkably in SW480 cells after the therapy of ALA-PDA than before. Content of P27 mRNA didn’t change significantly. Conclusion: The inhibitory effects of ALA-PDT to the proliferation of colon carcinoma SW480 cell line might be caused by its up-regulation to P21 over-expression, and down-regulation to cyclinE, and CDK2.
［Key words］ colonic neoplasma; cell cycle; photodynamic therapy; proliferation inhibition
有研究表明，光动力治疗(Photodynamic therapy, PDT)可诱导肿瘤细胞出现G0~G1期阻滞，使肿瘤细胞不能顺利进入有丝分裂期（S期），从而减缓肿瘤的增殖[1]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinate acid,5-ALA)是一种新型内源性光敏剂, ALA-PDT对肿瘤细胞有抑制作用,但其作用机理尚不十分明确，因此选用ALA为光敏剂对结肠癌细胞株SW480进行PDT处理，并对处理前后细胞周期关卡相关因子P21、P27、cyclinE、CDK2 mRNA表达水平进行检测，旨在对5-ALA-PDT对肿瘤细胞的抑制作用及其机理有所了解，本实验完成于2007年6月。
1 材料与方法
1．1 细胞株
人结肠癌细胞株SW480，由第四军医大学实验动物中心细胞库引进。
1．2 试剂与主要设备
光敏剂5-ALA 、噻唑蓝（Sigma，美国）；酶标仪(SUNRISE，澳大利亚)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa, 日本)。
1．3 细胞培养
SW480细胞常规在RPMI1640培养液(含10%胎牛血清，青霉素100 kU/L,链霉素50 g/L)中培养。置于CO2孵箱中，恒温37 ℃，5%CO2，饱和湿度。取对数生长期细胞用于实验。
1．4 PDT处理
光敏剂5-ALA 于实验当天于避光条件下使用无血清、无抗生素RPMI1640培养液稀释配制成工作液(1 mmol/L)，过滤除菌后加入培养板（6孔板2 ml/孔、96孔板150 μl/孔），37 ℃孵育4 h后弃去工作液，PBS漂洗2遍，加入新鲜常规培养液，置于暗室。用半导体激光仪(距光斑3 cm处输出功率15 mW，能量9 J/cm2)垂直照射培养孔25 min，照射后细胞继续培养至实验设计各组时间点。
1．5 实验分组
A组为实验组，按上述方法进行PDT处理；B组为对照组，按常规进行培养。每组按PDT结束后24、48、72、96 h分设4个时相点。
1.6 RNA的提取及RT-PCR
PDT后24 h,取实验组及对照组标本, 用Trizol 常规提取总RNA, 经核酸蛋白紫外分析仪(Beckman DU800) 检测, A260/280比值为1.8~1.95。取1 μg总RNA 按以下条件进行逆转录：50 ℃，30 min；99 ℃,5 min；5 ℃,5 min共1个循环。以β-肌动蛋白(β-actin) 作为内对照,进行半定量聚合酶联反应(PCR) 扩增。引物由赛百盛公司设计合成。P21：sense,5’-ATGTCAGAACCGGCTGGGGA-3’，antisense,5’-GCCGTTTTCGACCCTGAGAG-3’，目的片断长427 bp；CyclinE: sense,5’-AATAGAGAGGAAGTCTGG-3’ antisense， 5’- AGATATGCAACCTGCATG-3’，目的片断长440 bp；P27:sense,5’-GGCAAGTACGAGTGGCAAGAG -3’antisense， 5’- CCATTCCATGAAGTCAGCGAT -3’，的片断长498 bp；CDK2：sense,5’-GCCAGAAACAAGTTGACGGGAGA-3’,antisense,5’-TGGGTGTAAGTACGAACAGGGAC-3’目的片断长422 bp;β-actin: sense,5’-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3’,antisense,5’-GTCACGCACGATTTCCCGCT -3’，目的片断长619 bp。按以下条件进行PCR反应：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min ，扩增30个循环。取5 μl PCR 产物电泳,用数码凝胶图像分析系统作条带灰度扫描。结果以PDT后24 h目的条带与对应的β-actin比值表示(平均灰度值×面积)。
1.7 统计学处理
实验采用SPSS11.0软件进行数据处理，采用t检验，结果用x±s表示，取P 0.05为有显著性差异。
2 实验结果
2．1 CDK2 mRNA表达
ALA-PDT处理后24 h，SW480细胞的CDK2 mRNA的表达即有明显下降(P 0.05)，96 h降到最低。对照组各时相点CDK2 mRNA水平基本保持一致。实验组各时相点与对照组相比均存在明显差异(P 0.01)。见图1、表1。表1 ALA-PDT处理后SW480细胞CDK2mRNA含量
2．2 CyclinE mRNA的表达
对CyclinE mRNA的检测结果显示，ALA-PDT后CyclinE mRNA的相对含量在0.28~0.34，各时相点的表达稳定在一个较低的范围内；对照组各时相点CyclinE mRNA的表达明显高于实验组（P 0.01），相对含量达到0.81~0.86（图2、表2）。
2．3 P27 mRNA含量
实验结果显示，经ALA-PDT处理后，实验组和对照组SW480细胞各时相点的P27 mRNA的相对含量分别在0.36~0.46和0.37~0.42，统计结果显示，实验组与对照组各时相点没有显著差异（P 0.05）。见图3、表3。
2．4 P21 mRNA的表达
对P21 mRNA的检测结果显示，ALA-PDT处理后24 h，P21 mRNA的相对含量达到0.77，明显高于对照组的0.53（P 0.05），ALA-PDT后48~96 h，P21 mRNA的表达提高到0.85左右，而对照组没有明显改变。实验组各时相点P21 mRNA的表达均明显高于对照组（P 0.05、P 0.01）。见图4、表4。 注：1、3、5、7为对照组24、48、72、96 h时相点；
3 讨论
PDT亦称光化学疗法，是指光敏物质经特定波长的光照射后，产生光敏作用，是用于肿瘤及异常细胞过度增生等非恶性疾病的诊断、治疗的一种方法[1~3]。单态氧（1O2）是光敏过程中最主要的一种工作介质，与脂质、蛋白、核酸等多种生物分子发生反应，使其氧化失活[2~4]。ALA通过在体内形成具有光毒性的原卟啉IX(protoporphyrin IX, PpIX)发挥作用[5]。研究表明肿瘤细胞的高活性，及其PBGD与FC等关键酶的活性与正常细胞有所不同, 可使ALA诱导的PpIX选择性在肿瘤组织中高浓度蓄积[6~8]。ALA及其衍生物具有的代谢快、毒性低、对肿瘤细胞高选择性杀伤等优点使之被视为一类极具前景的新型光敏剂。
目前认为，肿瘤属于细胞周期性疾病，如能对肿瘤细胞的生长周期中的关卡（checkpoint）进行调控，使其产生周期阻滞，将对抑制肿瘤增殖、延缓肿瘤发展产生有利作用。P21(cyclin inhibition protein 1)与 P27 (kinase inhibition protein 1)同属CKIs，能广泛抑制G1期、S期cyclinD1-CDK4/6，cyclinE-CDK2等多种复合物的激酶活性，使细胞阻滞于G1期。被认为是细胞周期G1/S转换的关键[9，10] 。
本研究结果显示，ALA-PDT处理后24~96 h，CDK2与CyclinE各时相点的mRNA含量明显低于对照组。对P21检测结果显示，PDT后mRNA蛋白含量显著升高，实验组96 h点高于同组24 h点。对照组各时相点的表达较实验组明显偏低。而与P21不同，ALA-PDT后P27 mRNA表达与对照组相比，各时相点均处于相似水平，未见明显差异。结果说明，ALA-PDT后24~96 h，P21在转录水平上表现为过表达，CDK2与CyclinE的表达则呈减弱趋势，而P27的表达没有显著的提高。有国外学者报道，PDT能够上调OVCAR-3、A431等肿瘤细胞P21的表达，下调CyclinD1、CyclinE及其它们的催化亚基CDK2/6的表达。同时，PDT还使CyclinE-CDK2-P21复合物的活性提高，CyclinE-CDK2/6复合物的活性下降。细胞生长受到抑制，表现为时间依赖性的G0/G1期周期阻滞[11，12]。结合相关文献及此前的研究，认为ALA-PDT可能在转录水平通过诱导CDK抑制蛋白P21的高表达，对CyclinE及其配体CDK2的表达产生抑制，并有可能抑制Cyclin-CDKs复合物的活性，使细胞阻滞于G0/G1期，产生增殖抑制。
【参考文献】
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