内容
作者：李红， 苏 敏， 胡 蓉， 黄 悦 作者单位：贵阳医学院 组织学与胚胎学教研室， 贵州 贵阳 550004
【摘要】 目的： 探讨不同时期人胎肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡。方法： 收集人胎35例，采用常规组织学HE染色、免疫组织化学细胞凋亡（TUNEL法）染色和细胞计数法进行研究。结果： 9周，人胎肠系膜淋巴结原基内未见凋亡的淋巴细胞。11~12周，有极少量淋巴细胞凋亡，13~32周，各胎龄段均有淋巴细胞凋亡。凋亡的淋巴细胞呈单个分布且多被巨噬细胞所吞噬。经统计学处理，各胎龄段淋巴细胞凋亡数差异无显著性（P＞0.05）。结论： （1）淋巴细胞凋亡是人胎肠系膜淋巴结发育过程中的普遍现象；（2）人胎发育时期，肠系膜淋巴结通过细胞凋亡方式对淋巴细胞的发育有一定筛选作用。
【关键词】 淋巴结； 肠系膜； 人； 胎儿； 淋巴细胞； 凋亡
Lymphocyte Apoptosis of Mesenteric Lymph Nodes during
Different Stages of Human Fetus Development
LI Hong, SU Min, HU Rong, HUANG Yue
（Department of Histology and Embryology, Guiyang Medical Colledge, Guiyang 550004, Guizhou, China）
［Abstract］ Objective: To study the apoptosis of lymphocytes in mesenteric lymph nodes （MLNs）during different stages of human fetus development. Methods： Thirty-five human fetuses were collected. The Hermatoxylin-Eosin（HE） staining， immunohistochemistry apoptosis method (in-situ dT, dT-mediated dUTP nick labeling，TUNEL), and cytometry were used in this study. Results： At the 9th week of fetal age, no apoptosis lymphocyte was seen in the primordium of the MLNs. In 11~12 weeks of fetal development, a few of apoptosis lymphocytes could be found. Obvious apoptosis lymphocytes were observed from the 13rd week to the 32nd week. They occurred singly and were phagocytized by macrophage. But there was not distinct difference between each stage of the developing fetuses (P 0.05)．Conclusions： (1) The apoptosis of lymphocytes is a common phenomenon during MLNs growth in human embryo development; (2)During the development of human fetus, the MLNs have screening function to lymphocytes through apoptosis.
［Key words］ lymph nodes； mesentery； persons； fetus； lymphocyte； apoptosis
细胞凋亡（apoptosis）不仅发生在一些疾病过程中，在胚胎发生、器官发育等方面也有重要的作用[1，2]。目前淋巴细胞的凋亡已有较多报道，但多侧重于对动物在体或离体及人离体淋巴细胞的研究，然而在人胎肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes, MLNs）发生过程中淋巴细胞凋亡的动态情况如何[3，4]？为此，于2005年1月拟探讨人胎儿MLNs不同时期相关淋巴细胞凋亡的变化规律，以期对人胎肠系膜淋巴结的发生和腹腔内免疫防御的研究提供形态学资料。
1 材料与方法
1.1 材料
收集因故中止妊娠的人胎35例,各例均测量顶臀长（crown-rump length，CRL）,按Patten[5]标准确定胎龄（表1）。表1 胎龄、顶臀长及例数分布
1.2 主要试剂
TUNEL（In-situ dT dT-mediated dUTP nick labeling）法染色细胞凋亡检测试剂盒（In situ cell apoptosis detection kit I, POD）和显色剂（Diaminobenzidine, DAB），均由武汉博士德生物制剂公司提供。
1.3 方法
各例均取部分肠系膜淋巴结，用10％Formalin固定，常规石蜡包埋，制成4 μm连续切片。进行常规HE染色和免疫组织化学TUNEL法染色。
免疫组织化学TUNEL法染色主要步骤：切片脱蜡下行入水，入3%H2O2 10 min，蒸水洗5 min，3次，依次加入标记缓冲液和标记液37 ℃孵育120 min，TBS洗3 min，3次，加入封闭液，封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体37 ℃孵育30 min，TBS洗3 min，3次，TBS1∶100稀释SABC，37 ℃孵育60 min，TBS洗5 min，3次，DAB-H2O2液显色，中性树胶封片。
方法对照：均用TBS缓冲液代替标记液，余步骤相同。
1.4 切片观察、图像分析及数据处理
以有核阳性细胞数/视野（物镜40倍目镜10倍）对人胎肠系膜淋巴结内凋亡的淋巴细胞进行计数。每胎龄段标本随机取5例，每例取非连续切片2张，每张计数5个视野，将各胎龄段淋巴细胞凋亡数两两比较。用SPSS12.0进行统计学处理。
2 结果
2.1 淋巴细胞凋亡的HE染色观察
光镜下，经HE染色的凋亡的淋巴细胞主要表现为胞体变小、胞质浓缩、嗜酸性变、核染色质凝集成块、核固缩和颜色深染、致密度高。
9周，人胎肠系膜淋巴囊腔内淋巴结原基形成，未见凋亡的淋巴细胞。11~12周，淋巴结原基周的淋巴囊壁结缔组织形成被膜，原基增大，淋巴细胞增多并集中于一侧（图1）。15周以后，形成早期髓索，索间的间隙分化为淋巴窦，23周时皮质可辨别，并且在皮质内见初级淋巴小结，29周以后，随胎龄的增加，皮质继续增厚，可辨别浅层皮质（内有较多的初级淋巴小结）与薄层副皮质区，在淋巴结内均可见凋亡的淋巴细胞，单个散在分布于MLNs内（图2~4）。可见巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞的现象（图1~4)。
2.2 淋巴细胞凋亡的免疫组织化学观察
光镜下，凋亡的淋巴细胞经免疫组织化学TUNEL法染色后，免疫反应产物呈棕黄色颗粒，位于胞核内（图5）。对照片结果为阴性。9周，人胎肠系膜淋巴结原基内未见凋亡的淋巴细胞。11~12周，出现极少的淋巴细胞凋亡，散在分布（图5）。早期凋亡的淋巴细胞，核染色质成大小不等的深褐色颗粒，边集于核膜下，形成环状核（图5~7）；晚期细胞核染色质凝集成块，核固缩，深染,进而核碎裂，形成凋亡小体（图7、图8）。
13~32周，各胎龄段均见有淋巴细胞凋亡，凋亡的淋巴细胞数略有增加，但经细胞计数及统计学处理，人胎肠系膜淋巴结凋亡的淋巴细胞细胞计数在各胎龄段间差异没有显著性（P＞0.05）。
3 讨论
细胞凋亡是生命有机体内正常的生理现象，是有核细胞在一定条件下通过启动自身的内部机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程，这种基因控制下的细胞自我消亡过程,亦称为程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD），细胞凋亡是多细胞动物生命活动过程如胚胎发生过程中重要组成部分[1~9]。本实验观察到从11周MLNs原基形成到32周各胎龄段肠系膜淋巴结发育过程中均有淋巴细胞凋亡现象存在，证实了淋巴细胞凋亡也是人胎MLNs发育过程中的普遍现象。有研究报道，中枢淋巴器官内，绝大多数的与自身抗原发生反应的淋巴细胞往往不能发育成熟而被筛选掉，这一过程是通过细胞凋亡的方式实现的[10]。本实验观察到在外周淋巴器官发育过程中，淋巴细胞凋亡也作为一种普遍现象存在，这与一些学者认为胎儿发育时期淋巴细胞是在中枢淋巴器官内获得死亡信号,而在外周凋亡的观点相符合[1，11，12]。同时，也说明迁入MLNs内的初始T、B细胞大多数按正常规律发育分化。提示在人胎淋巴结的发育过程中，淋巴结对来自中枢淋巴器官的淋巴细胞仍存在一定的筛选作用。本实验研究表明，随着胎龄增加，淋巴结体积逐渐增大，凋亡细胞细胞数量并未随胎龄增大而明显增加（P＞0.05），提示了人胎发育过程中，淋巴结内成熟淋巴细胞数量呈逐渐增多趋势。
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