内容
作者：周梅珍,蒋舒寒,曹林,胡敏进,华子春 作者单位：南京大学 医药生物技术国家重点实验室,江苏 南京
【摘要】 目的： 提高肌钙蛋白Ⅰ（troponin Ⅰ,Tn Ⅰ）在大肠杆菌中的可溶性表达并进行分离纯化。方法和结果： 将质粒CBDintein/pTWIN1和Tn Ⅰ/pET28a分别用Nco Ⅰ及Xho Ⅰ双酶切,回收。回收后的载体CBDintein/pTWIN1与Tn Ⅰ片段用T4 连接酶连接,得到重组质粒CBDinteinTn Ⅰ/pTWIN1。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达得到融合蛋白CBDinteinTn Ⅰ。经chitin亲和层析和intein介导的融合蛋白自我裂解,纯化得到重组Tn Ⅰ。结论： 通过CBDintein融合表达系统一步式裂解分离纯化能方便快捷地获得可溶性的Tn Ⅰ。
【关键词】 肌钙蛋白I； 表达； CBDinteinTn Ⅰ； chitin亲和层析
肌钙蛋白Ⅰ（troponin Ⅰ，Tn Ⅰ）是原肌球蛋白复合物中肌钙蛋白的组成成分之一,目前在横纹肌中主要发现了3种异构体,其中2种存在于骨骼纤维（快骨骼纤维和慢骨骼纤维）中,1种存在于心肌中。骨骼肌Tn Ⅰ由181个氨基酸残基组成,相对分子质量为21 000。Tn Ⅰ的经典功能是作为原肌球蛋白的组成部分参与条纹肌的钙离子依赖性收缩［1］。Moses等［2］在1999年发现了快骨骼纤维中Tn Ⅰ新的生物学功能。他们通过鸡胚尿囊膜和小鼠角膜试验,揭示了Tn Ⅰ能够抑制血管新生的功能。体外试验中,其生物活性比目前已进入临床实验的同类型血管生成抑制剂（包括endostatin和angiostatin）强10～100倍,是一种极具研究和开发价值的新型抗肿瘤药物。但是,长期以来由于重组Tn Ⅰ在大肠杆菌中表达时易形成无生物活性的包涵体产物,因此有生物活性Tn Ⅰ的表达和纯化一直成为Tn Ⅰ研究和应用的瓶颈环节。采用ProgelTSK G3000WXL柱纯化重组包涵体形式的Tn Ⅰ是目前效果最好的纯化方法,但它步骤繁琐,其中的变复性步骤对蛋白活性亦有很大影响［35］。本研究旨在寻找一种能提高Tn Ⅰ在大肠杆菌中可溶性表达及简易便捷的分离纯化方法,以促进Tn Ⅰ进一步的功能研究和应用。
1 材料与方法
1.1 试剂、质粒与菌株
大肠杆菌(E.coli)Top10、BL21(DE3)、含Tn Ⅰ 基因的pET28a质粒来自本实验室；CBD(chitinbinding domain)intein/pTWIN1质粒和chitin介质购自NEB公司；限制性内切酶、T4连接酶等酶类购自大连TaKaRa公司；IPTG购自华美生物工程公司。
1.2 方 法
1.2.1 重组质粒的构建
质粒CBDintein/pTWIN1和Tn Ⅰ/pET28a分别用Nco Ⅰ、 Xho Ⅰ双酶切,回收。回收后的载体CBDintein/pTWIN1与Tn Ⅰ片段用T4 连接酶连接,即得到重组质粒CBDinteinTn Ⅰ/pTWIN1。将重组质粒转化E.coli Top10,用含有氨苄霉素的LB平板筛选阳性克隆,挑取单克隆进行PCR鉴定,酶切。阳性克隆送上海英骏（Invitrogen）公司测序鉴定。
1.2.2 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
1.2.2.1 含重组质粒的大肠杆菌在3 ml LB培养基中的表达 将重组质粒CBDinteinTn Ⅰ/pTWIN1转化BL21（DE3）大肠杆菌,再将单克隆接种到3 ml含氨苄霉素的LB培养基中,37 ℃培养过夜。过夜菌按1∶1 000的比例转接到3 ml的LB液体培养基中37 ℃摇菌培养,当A600 nm达到0.8时,加入终浓度为0.5 mmol·L﹣1的IPTG,37 ℃诱导3 h。离心收获菌体,将菌体重新悬浮于300 μl的PBS中,调节A600 nm一致,超声破碎,12 000 r·min-1 4 ℃离心10 min,取菌体裂解液,上清及沉淀进行SDSPAGE分析。Grabit 2.5分析软件对SDSPAGE电泳图谱进行灰度扫描分析。
1.2.2.2 含重组质粒的大肠杆菌在500 ml LB培养基中的表达 将重组质粒CBDinteinTn Ⅰ/pTWIN1转化BL21（DE3）大肠杆菌,再将单克隆接种到500 ml含氨苄霉素的LB培养基中,37 ℃摇菌培养。当A600 nm达到0.8时,加入终浓度为0.5 mmol·L-1 的IPTG,25 ℃培养5 h,离心收获菌体。将表达的菌体重新悬浮于25 ml B1（20 mmol·L-1 TrisHCl，500 mmol·L-1 NaCl，1 mmol·L-1 EDTA，pH 8.5）平衡缓冲液中,超声破碎,12 000 r·min-1 4 ℃离心30 min,取上清。
1.2.3 融合蛋白CBDinteinTn Ⅰ/pTWIN1的纯化
4 ℃下用B1平衡缓冲液对柱床体积为5 ml的chitin亲和层析柱进行平衡,然后将上清加载到chitin柱上,再用3倍柱床体积的B2缓冲液（20 mmol·L-1 TrisHCl，500 mmol·L-1 NaCl，1 mmol·L-1 EDTA,pH 7.0）洗柱。洗柱完毕,将层析柱的进样端和出样端封闭,于4 ℃下放置17 h。pH值的改变诱导融合蛋白中intein C端的肽键裂解,Tn Ⅰ从融合蛋白中释放。17 h后用B2缓冲液洗脱并收集，再用蛋白剥脱液（0.3 mol·L-1 NaOH）去除仍结合在层析柱上的蛋白。
2 结 果
2.1 克隆载体的构建与鉴定
Tn Ⅰ/pET28a经Nco Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后得到大小为550 bp的Tn Ⅰ片段（图1）,酶切、回收后的载体CBDintein/pTWIN1与Tn Ⅰ片段连接,得到重组质粒CBDinteinTn Ⅰ/pTWIN1。重组质粒经PCR鉴定为阳性克隆,经测序证明与目的基因的序列完全相符。
2.2 融合蛋白的诱导表达
经IPTG诱导,含表达质粒CBDinteinTn Ⅰ/pTWIN1的BL21(DE3)在相对分子质量为43 000处有一明显的诱导表达条带,与CBDinteinTn Ⅰ的相对分子质量一致（图2）。诱导温度为37 ℃时,融合蛋白占菌体总蛋白的44.8%,其中大部分以不可溶的包涵体形式存在于沉淀中,一部分以可溶性表达产物形式存在。相形之下,当Tn Ⅰ/pET28a在大肠杆菌中表达时,Tn Ⅰ完全以包涵体形式存在［6］。
2.3 融合蛋白的纯化
含重组质粒的大肠杆菌在500 ml LB培养基中表达,经SDSPAGE扫描分析,融合蛋白占上清的32.3%。然后进行chitin亲和层析介质分离纯化,电泳结果显示,融合蛋白有一部分未与chintin柱结合而存在于穿过液中。Buffer 2洗柱后pH发生改变,诱导融合蛋白中的intein自我裂解,释放Tn Ⅰ。经洗脱收集后最终得到2.42 mg的Tn Ⅰ,纯度为80%。洗脱液经Western blotting鉴定为阳性。
3 讨 论
本研究将Tn Ⅰ与CBDintein进行融合,通过载体pTWIN1在大肠杆菌中表达,发现部分融合蛋白表达产物以可溶性形式表达。通过intein自我裂解介导的一步式切割分离和chitin亲和纯化,快捷有效地获得了可溶性的Tn Ⅰ。这种纯化工艺将分离纯化和融合蛋白质的切割融为一体,避免了传统分离纯化工艺中将分离纯化与融合蛋白质切割分步进行的复杂工艺，减少了蛋白质的损失,为提高Tn Ⅰ的可溶性表达提供了一个新的策略。本研究为Tn Ⅰ作为抑制肿瘤血管生成药物的继续开发和深入研究奠定了基础。
【参考文献】
［1］EBASHI S，KODAMA A，EBASHI F.Troponin Ⅰ preparation and physiological function［J］.Biochem,1968，64：465477．
［2］MOSES M A，WIEDERSCHAIN D，WU I,et al.Troponin Ⅰ is present in human cartilage and inhibits angiogenesis［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1999，96：26452650．
［3］WADMAN M.Anticancer activity of endostatin redeemed［J］.Nature,1999，397(6720):549．
［4］FELDMAN L,ROULEAU C.Troponin Ⅰ inhibits capillary endothelial cell proliferation by interaction with the cells bFGF receptor［J］.Microvascular Research，2002，63:4149．
［5］KERN B E,BALCOM J H,ANTONIU B A，et al.Troponin I peptide (Glu 94Leu 123)，a cartilagederived angiogenesis inhibitor：in vitro and in vivo effects on human endothelial cells and on pancreatic cancer［J］.Gastrointest Surg，2003，7(8):961969．
［6］颜明，华子春.人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的表达及建立其快速复性方法［J］.东南大学学报:医学版，2005，24(1):3638