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反义寡核苷酸抑制survivin表达来增强乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB231对多西他赛敏感性的研究

内容

作者：张静,姜藻作者单位：1.蚌埠市中心医院肿瘤内科，安徽蚌埠； 2.东南大学附属中大医院肿瘤科，江苏南京

【摘要】目的：探讨利用反义寡核甘酸（ASODN）技术封闭乳腺癌细胞株survivin基因,观察survivin基因表达下调能否诱导细胞凋亡及增强对多西他赛(docetaxel)药物敏感性。方法： Survivin ASODN单独及联合多西他赛处理乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB231,RTPCR检测survivin mRNA的表达,免疫细胞化学方法和Western blotting检测survivin蛋白表达,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞的生长抑制率。结果： Survivin ASODN可下调人乳腺癌细胞株中survivin mRNA 和蛋白质的表达；survivin ASODN 与多西他赛联合用药组相比对照组和多西他赛组可明显抑制细胞株的生长（P 0.01)。结论： Survivin ASODN明显抑制survivin基因在乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB231中的转录及翻译,明显提高乳腺癌对多西他赛的敏感性。

【关键词】生存素；反义寡核苷酸；多西他赛；乳腺癌细胞株

生存素（survivin）作为凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成员之一,具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重作用［1］。 Survivin基因在几乎所有恶性肿瘤组织中出现高表达,而在正常成人组织中不表达(胸腺、胎盘、子宫内膜除外)［2］,survivin蛋白与日渐增多的乳腺癌的发生、发展及预后密切相关［3］,这种选择性表达使之成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的研究热点。多西他赛是目前治疗转移性乳腺癌单药有效率最高的药物,尽管如此,多西他赛单药的有效率也只在40%～68%［4］,而且对复发和多处转移的患者易出现化疗耐药。本研究旨在探讨利用反义寡核苷酸（ASODN）封闭survivin基因的表达是否能增加乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性,为临床提高乳腺癌化疗敏感性提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF7和MDAMB231细胞株由蚌埠医学院实验中心提供；LipofectamineTM2000购于Invitrogen公司；G418购自Sigma公司；总RNA提取试剂盒及GAPDH购于TaKaRa公司；兔抗人多克隆抗体survivin购于Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体购于北京中杉金桥；ECL发光试剂盒购自Pierce公司；多西他赛（Aventis Pharma Dagenham公司产品）溶解于二甲亚砜（DMSO,GIBCO公司产品）,4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸的设计及合成 Survivin ASODN是针对survivin mRNA的编码序列设计（参照文献［5］）,序列为5′ccc agc ctt cca gct cct tg3′（第232251）。无义寡核苷酸（NSODN）作为反义序列的对照,自行设计序列为5′gca cct agt ctc cct cc3′,经基因库BLAST比对,未发现同源序列。以上反义寡核苷酸均采用逐步硫代修饰,委托上海生工生物工程有限公司代为合成。使用时用无小牛血清的RPMI 1640培养液溶解。

1.2.2 脂质体介导survivin ASODN转染MDAMB231细胞取对数生长期MDAMB231细胞计数并调整细胞浓度为2×105ml-1,接种于6孔培养板中；24h后,当细胞达到60％～80％融合贴壁时取两试管。A管：加10μl Lipofectin,以无小牛血清的RPMI 1640培养液补充至100μl；B管：分为对照、Lipofectin、NSODN（300 nmol· L-1）、浓度不等的ASODN(终浓度分别为100、300、500 nmol·L-1),以无小牛血清的RPMI 1640培养液补充至100μl。将两试管中的液体轻轻混合摇匀孵育,洗涤后换液培养,根据实验要求培养24～48h后收取细胞进行检测。

1.2.3 RTPCR检测survivin mRNA的表达分别收集各组细胞，Trizol试剂提取总RNA,RTPCR扩增survivin mRNA并进行比较;引物根据GenBank报道的survivin基因序列（no.NM_001168）设计。Survivin基因（134bp）上游引物为5′gga cca ccg cat ctc tac att c3′,下游引物为5′aga aga aac act ggg cca agt c3′；βactin（275bp）上游引物为5′gct cac cat gga tga tga tat c3′,下游引物为5′gcc aga ttt tct cca tgt cgt c3′。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳,观察结果并拍照。

1.2.4 免疫细胞化学法检测survivin蛋白的表达分为阴性对照（PBS代替一抗）组、对照组、300nmol·L-1NSODN组和300 nmol·L-1survivin ASODN组。取1×105ml-1MDAMB231细胞,6孔板爬片,每孔加细胞悬液2ml,待70％～80％汇片后弃培养液,按转染步骤转染,5～6h后换含10％小牛血清的培养液继续培养48h后检测。免疫细胞化学方法检测按试剂盒操作步骤。镜下观察survivin蛋白表达的情况,胞浆呈黄色或棕黄色为阳性。

1.2.5 Western blotting检测survivin蛋白的表达分为对照组、300 nmol·L-1 NSODN组和300 nmol·L-1survivin ASODN 组，作用于MCF7细胞。收集各组细胞(5×106),用细胞裂解液提总蛋白,进行SDSPAGE凝胶电泳后将蛋白质转移至PVDF膜上。封闭后依次加入一抗（兔抗人survivin多抗）和二抗（羊抗兔辣根过氧化物酶）,TBST漂洗后暗室曝光摄影。

1.2.6 Survivin ASODN与多西他赛联用或单用对细胞的影响取对数生长期MCF7细胞,以每孔1×105接种于96孔板。分为对照组、 Lipofectin组、 100 nmol·L-1 ASODN组、 300 nmol·L-1 ASODN 组、 500 nmol·L-1ASODN组、 20mg·L-1多西他赛组和 300 nmol·L-1ASODN +20mg·L-1多西他赛组。培养48h后镜下观察。

1.2.7 乳腺癌细胞对多西他赛敏感性的分析取对数生长期MCF7细胞,以每孔1×105接种于96孔板。分为对照组、 Lipofectin组、 300 nmol·L-1NSODN组、 300nmol·L-1ASODN 组、多西他赛组、300nmol·L-1ASODN+多西他赛组、 300nmol·L-1NSODN+多西他赛组、 Lipofectin+多西他赛组（上述各组多西他赛质量浓度均为20 mg·L-1）,每组设3个复孔。48h换液时加入多西他赛至设定浓度,再继续培养48h中止。上述各组培养中止前加入10mg·ml-1 MTT液,同样条件下培养4h后吸出培养液,加入200μl DMSO振荡溶解,空白对照调零,酶标仪检测吸光值,测定波长为570nm。抑制率＝（空白对照组值-实验组值）/空白对照组值×100％。比较各组对乳腺癌细胞生长抑制的影响。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.5软件处理,数据以x-±s表示,两因素分析使用两因素析因设计的方差分析,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin ASODN对survivin mRNA表达的抑制作用对照组、Lipofectin组和无义寡核苷酸组survivin mRNA表达较强,组间无明显差别；100 nmol·l-1survivin ASODN组表达较弱,300 nmol·L-1和500 nmol·L-1浓度组均无表达（图1）。随着时间的延长survivin mRNA表达减弱（图2）。因此,survivin ASODN对survivin mRNA的抑制作用有浓度和时间依赖性。1.Marker； 2.对照组； 3.Lipofectin组； 4.NSODN 300 nmol·L-1组； 5.Survivin ASODN 100 nmol·L-1组； 6.Survivin ASODN 300 nmol·L-1组； 7.Survivin ASODN 500 nmol·L-1组； 8.Marker图1 Survivin ASODN对MDAMB231细胞

2.2 Survivin ASODN下调MDAMB231细胞内survivin蛋白的表达 MDAMB231细胞内 survivin蛋白阳性结果呈胞浆染色棕黄色细颗粒状（图3A、B）；以PBS代替一抗的阴性对照细胞,细胞核呈深蓝色,胞浆透明,无棕色颗粒(图3D)。结果表明survivin蛋白的活性能被survivin ASODN抑制(图3C)。A.对照; B.NSODN; C.Survivin ASODN; D.阴性对照

2.3 Survivin ASODN下调MCF7细胞内survivin蛋白的表达由图4可知survivin蛋白的表达能被survivin ASODN抑制，而NSODN组与对照组相比无明显变化。

　　2.4 Survivin ASODN单用或联合多西他赛诱导MCF7细胞凋亡对照组、Lipofectin组中细胞凋亡均不明显,与对照组相比,不同浓度ASODN组、多西他赛组及两药联合组均可见到部分细胞呈现凋亡的特征性变化：细胞缩小,细胞皱缩,染色质凝集,核固缩并断裂成数个大小不等的圆形颗粒,即凋亡小体。ASODN各组存在浓度依赖性,随着ASODN浓度增加凋亡细胞数目增多,联合组凋亡细胞数目增加得最明显。

2.5 Survivin ASODN增加MCF7细胞对多西他赛的敏感性 ASODN与多西他赛联合作用组的细胞生长抑制率达80.50％,显著高于多西他赛或ASODN单用组的细胞生长抑制率63.24％及51.79%（P＜0.01）,单独应用多西他赛与NSODN联合多西他赛的细胞抑制率间无明显差异（P＞0.05）（表1）。表 1 不同处理方法对MCF7细胞生长抑制率比较

3 讨论

Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族的新成员,其表达具有明显的细胞周期依赖性,在G2/M期高表达。Survivin蛋白能与细胞周期依赖激酶CDC2相互作用,在Thr34上被CDC2cyclinB1磷酸化,这种磷酸化被认为与抑制细胞凋亡有关［6］。研究还表明，survivin蛋白在微管稳定,纺锤体及中心体的形成过程中也起着重要作用,抑制survivin基因的表达可引起纺锤体缺陷并促进凋亡［7］,此外它还参与了肿瘤血管形成。Survivin蛋白具有独特的组织分布,在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤组织中均有较强表达,survivin基因的高表达可能使乳腺癌细胞更容易逃避G0/G1期和G2/M期的分子检查机制而不发生凋亡,并与化疗的耐药也有关［8］,故封闭survivin基因的表达能达到促进肿瘤细胞凋亡及提高化疗药敏感性,同时对机体不会产生较大的影响。

我国乳腺癌发病率近年来不断增高,作为一种易血行转移的恶性肿瘤,目前化疗在其综合治疗中占有重要的地位。多西他赛是一种比紫杉醇抗肿瘤活性还强的化疗新药,自美国食物药品管理局 (Food and Drug Administration,FDA)1998年批准上市后,它已渐成为包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤化疗的一线用药,Ⅲ期临床试验结果显示,以多西他赛为基础的辅助化疗方案能提高早期乳腺癌的长期生存率,并降低复发［9］,而对化疗药耐药是延长乳腺癌患者生存期及改善生活质量的最大障碍之一,因此研究多西他赛耐药发生的分子生物学机制并寻找新的治疗靶点是非常有意义的。目前多西他赛耐药机制尚未彻底清楚,但其通过作用于微管而发生抗肿瘤作用与survivin抗凋亡作用具有相同的位点。

应用目前较为流行的RNAi技术来研究药物敏感性的成本较高,在我国还属于探索阶段,因此我们选用了相对而言较为简单的反义寡核苷酸技术来探讨对化疗药物敏感性的影响。在本实验结果中,我们所构建的靶向survivin ASODN具有高度特异性,RTPCR、免疫细胞化学方法和Western blotting检测发现survivin mRNA和蛋白的表达水平显著降低甚至被完全阻断。光镜下及MTT结果显示,下调survivin基因表达可以诱发乳腺癌细胞一定程度的自发凋亡并可明显提高对多西他赛的化疗敏感性,这也间接地提示survivin基因的过度表达可能参与了多西他赛的耐药。

总之,通过本实验证实：survivin ASODN可抑制乳腺癌细胞的生长,诱导乳腺癌细胞凋亡；survivin基因是较理想的肿瘤治疗靶分子,可有效促进肿瘤细胞凋亡及对化疗药物敏感性。我们相信,随着分子肿瘤学研究的深入和新的分子靶向药物的不断涌现,将会有更多的药物进入临床,为治疗乳腺癌带来新的突破。

【参考文献】

［1］ALTIERI D C.Validating survivin as a cancer therapeutic target［J］.Nat Rev Cancer，2003,3(1):4654．

［2］YAMASHITA S，MASUDA Y，KURIZAKI T，et al.Survivin expression predicts early recurrence in earlystage breast cancer［J］.Anticancer Res，2007,27(4C):28032808．

［3］张保宁.乳腺癌临床研究的回顾与展望［J］.中华医学杂志,2005,81(1):15．

［4］何声秀,吕丽荣.转移性乳腺癌化疗进展［J］.现代诊断与治疗,2002,13（3）：155158．

［5］OLIE R A，SIMOESWUST A P，BAUMAN B，et al.A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy［J］.Cancer Res,2000,60(11):28052809．

［6］HOU J Q，HE J，WEN D G，et al.Survivin mRNA expression in urine as a biomarker for patients with transitional cell carcinoma of bladder［J］.CMJ，2006,119（13）:11181120．

［7］CALADS H，JIANG Y，HOLLOWAY M P，et al.Survivin splice variants regulate the balance between proliferation and cell death［J］.Oncogene，2005,24(12):19942007．

［8］ANGELL H.A study into the potential role of survivin localization in resistance to druginduced apoptosis［J］.Bioscience Horizons,2008,1(2):8591．

［9］NABHOLTZ J M，RESSE D M，LINDSAY M A，et al.Evidence for the use of　 chemotherapy in breast cancer［J］.Int J Clin Oncol，2002，7( 4)：254264．

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