SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备_医药文献_医文献查询

SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备

内容

作者：鲍海逊,夏梅,缪凤琴，谢维，张建琼作者单位：东南大学发育与疾病相关基因教育部重点实验室,遗传与发育生物学系，江苏南京

【摘要】目的：表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb)。方法：原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段，从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白（N端205至419aa）基因片段，测序结果正确。将该基因片段插入pQE30中，构建重组质粒pQE30S1m,以重组质粒转化E.coli M15诱导表达HisS1m蛋白。纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb。结果：表达并纯化了重组蛋白HisS1m，获得1株抗HisS蛋白的mAb1H2。Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型。经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应，而与His蛋白无交叉反应。结论：成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARSCoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。

【关键词】严重急性呼吸综合征；SARS 冠状病毒；S蛋白；单克隆抗体

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是2002 年11 月爆发流行的一种新的传染病，该病传染性强，潜伏期短，进展快，死亡率高［12］。尽管目前SARS 疫情已得到控制，但仍存在复发的可能。因此，研制预防、诊断和治疗的方法具有重要意义。SARS 病原体的分离和鉴定研究表明，SARS冠状病毒(coronavirus)(SARSCoV)是一种新型的冠状病毒。其主要结构蛋白有S、E、M 和N，其中S蛋白是Ⅰ型膜糖蛋白(基因全长3 768 bp，编码1 255个氨基酸),在功能上可分为S1和S2：N端为亚单位S1,构成成熟刺突蛋白球部分；C 端为亚单位S2,形成细长突起的柄部分。S蛋白在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导病毒进入细胞的过程中起关键性作用。SARSCoV S蛋白识别宿主细胞上的受体与其它冠状病毒不相同,它主要是通过血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)作为其功能受体［34］。Wong等［4］发现S1的12～327 aa 和12～481 aa 不与ACE2结合,但S1的318～510 aa的193氨基酸区域可以有效地结合ACE2。此外，S蛋白是冠状病毒的主要抗原，其上有许多病毒抗体中和位点，研究证实S蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要成分，是用来研制保护性疫苗的最理想部位［57］。

本实验用PCR方法，以SARS病毒cDNA为模板，扩增S1m蛋白（N端613至1 256 aa）的基因片段，表达重组蛋白S1m，纯化后免疫BLAB/c小鼠,制备了单克隆抗体，以期为SARSCoV的早期检测、进一步研究S蛋白的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 SARS病毒cDNA 由北京华大基因有限公司提供。

1.1.2 菌株、质粒 E.coli M15、DH5α和质粒pQE30均为本实验室保存。

1.1.3 实验动物、细胞 BALB/c小鼠由本校动物中心提供；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞为本实验室保存。

1.1.4 试剂 ExTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司。BamH Ⅰ、Hind Ⅲ购自MBI公司，LB 固体、液体培养基、Ampicilin 由本实验室配制。DNA 回收试剂盒等购自Qiagen 公司，GeneRulerTM 1 kb DNA ladder 购自MBI公司。BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司，羊抗鼠抗体购自中山公司。引物合成及测序由上海申能博采公司承担。弗氏完全和不完全佐剂、新生牛血清及HRP羊抗鼠IgG均购自Sigma公司，HAT 及HT、PEG 购自南京医科大学，小鼠Ig亚型测定试剂盒( Isotrip kit)购自Boehringer Mannheim公司。RPMI 1640培养基购自Gibco公司。ECL显色底物均购自Pierce公司。PVDF 膜购自Schleicher Schull公司。针对S1m蛋白设计PCR上游引物为5′GCGGATCCGTAGTTCGTGATCTACCTTC3′，下游引物为5′GCAAGCTTCAACCCATGAAATCATCTGG3′ (划线部分为酶切位点)。

1.2 方法

1.2.1 S蛋白基因片段的获得和重组质粒的构建以SARS病毒cDNA为模板，利用特异性引物，经PCR获得S蛋白（N端205至419 aa）基因片段，利用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切位点，将目的基因插入质粒载体pQE30中，转化E.coli DH5α,扩增并提取质粒。重组质粒经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。经酶切鉴定正确的重组质粒送上海申能博采公司行核苷酸序列测定。

1.2.2 重组蛋白的原核表达与纯化将重组质粒pQE30S1m转化E.coli M15，加入0.05 mmol·L-1的IPTG，于30 ℃诱导3 h表达重组蛋白,表达产物用考马斯亮蓝染色后观察结果。以相同条件大量诱导表达重组蛋白，将离心后细菌沉淀用超声破碎，按说明书用Ni柱纯化HisS1m蛋白,用SDSPAGE鉴定纯化情况，并用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度，于-70 ℃保存。

1.2.3 动物免疫将纯化的重组蛋白HisS1m蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合免疫BALB/c小鼠,剂量为30 μg·只-1,每只小鼠腹腔注射0.4 ml,3周后加强免疫1次,剂量相同；佐剂改为弗氏不完全佐剂,2周后再加强免疫1次,剂量相同；4周后每只注射0.2 ml的纯抗原,不加佐剂。于末次免疫3 d后融合,融合当日眼眶采血,分离血清作为阳性对照。

1.2.4 阳性克隆的筛选及克隆化常规融合后,采用间接ELISA法检测抗体。用S1m重组蛋白包被酶标板,His蛋白包被酶标板作为对照孔,包被量均为30 ng·孔-1。用间接ELISA法检测,以TMB底物显色，测定A450 nm值。若与S1m的反应呈阳性,同时与His蛋白的反应呈阴性,P/N≥2.1者为阳性。阳性孔用有限稀释法亚克隆3次,至100%培养孔呈阳性时,扩大培养,建立分泌mAb的杂交瘤细胞株,并大量制备腹水及纯化。

1.2.5 mAb的特性鉴定 (1) 腹水mAb的效价测定：采用间接ELISA法。(2) mAb的Ig亚类测定：采用小鼠Ig亚型测定试剂盒(Isotrip kit)的亚类检测试纸进行测定。(3) mAb 特异性鉴定：采用Western blotting检测。HisS1m纯化蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定,蛋白质量浓度均为6 g·L-1,加入1/4体积的上样缓冲液,煮沸5～10 min。取2 μl行100 g·L-1SDSPAGE分离。同时加BL21菌液2 μl 作为阴性对照。将蛋白转移到PVDF膜上,以50 g·L-1 的脱脂奶粉于4 ℃封闭过夜。依次加抗S1m mAb (一抗杂交瘤细胞培养上清,1∶10稀释)和HRP2羊抗鼠IgG(二抗,1∶10 000稀释)室温下孵育1 h,最后用ECL底物显色。

2 结果

2.1 S1m基因的获得和重组质粒的构建

以SARS病毒cDNA为模板,通过PCR法扩增得到645 bp的两端带有BamHⅠ、Hind Ⅲ酶切位点的S1m基因片段（图1），将此片段与PQE30分别用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切消化，纯化后用T4 DNA 连接酶连接。

2.2 重组质粒的酶切鉴定

氨苄抗性的重组质粒转化菌 DH5a 经增菌后提取质粒，以Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切鉴定重组质粒,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后出现2条条带，其中1条约为3 500 bp,另1 条约为645 bp,对照空质粒经同样双酶切后只出现1条约为3 500 bp 条带(图2)。经酶切鉴定正确的重组质粒送上海申能博采公司行核苷酸测序，证明插入的序列是正确的（测序图略）。

2.3 蛋白诱导表达及纯化

转化纯化的重组质粒至感受态菌M15中，SDSPAGE 显示经IPTG诱导后蛋白获得大量表达，HisS1m融合蛋白以包涵体形式存在，通过裂解包涵体、复性和纯化获得目的蛋白，其相对分子质量与预期相符，见图3。

2.4 杂交瘤细胞株的建立

用 HisS1m蛋白免疫的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,融合率为98%。经间接ELISA法筛选,将S1m抗原检测阳性,His抗原检测阴性的杂交瘤细胞孔进行亚克隆,最后1次亚克隆达到100%阳性即建系。得到1株可稳定分泌抗S1m mAb的杂交瘤细胞株,命名为1H2。杂交瘤细胞体外连续传代20代并培养3个月以上,冻存半年复苏后,其能稳定分泌抗体且效价不降低。

2.5 抗 S1m mAb的特性鉴定

（1）腹水mAb的效价测定：间接ELISA法检测表明，1H2细胞株腹水mAb的效价为1∶4×105。（2） mAb的Ig亚类测定：采用Boehringer Mannheim公司的Ig亚型测定试剂盒检测结果显示,mAb1H2为IgG1a,轻链属于κ型。（3） mAb特异性鉴定：经Western blotting检测,mAb1H2只与HisS1m蛋白发生特异性反应,与His蛋白及M15菌裂解液中的蛋白均无交叉反应(图4)。

　　3 讨论

SARSCoV是冠状病毒科的新成员,外膜由3个糖蛋白S、M、E构成。其中的S蛋白是病毒表面形成的大的花瓣样突起,约含1 256个氨基酸，是弱酸性跨膜糖蛋白。它在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导膜融合进入细胞的过程中起重要作用，也是SARSCoV 最大、抗原性最强的结构蛋白［8］。最新研究发现，动物源性的SARS相似病毒S蛋白与人源性SARS病毒S蛋白有高度同源性，为SARS病毒的动物起源和人畜共患的可能性提供了新的依据［9］。在副流感3型病毒重组体中表达的SARSCoV S蛋白具有强免疫原性［10］。大鼠单纯鼻内点滴即可诱导高滴度的抗SARSCoV 中和抗体，抗体水平达到SARSCoV感染滴度的80%。值得注意的是,当S蛋白与M蛋白、E蛋白共同表达时，中和抗体滴度没有增加；在缺乏S蛋白表达的情况下，M 蛋白、E蛋白或N 蛋白的表达都不能诱导产生中和抗体［11］。国外有研究报道，将S蛋白截断片段的转基因植物（番茄和烟叶）喂食小鼠，SARSCoV特异性的IgA抗体水平显著提高［12］。这些研究结果都表明，在结构蛋白中S蛋白是重要的中和抗原和保护性抗原。

温坤等［13］原核表达了含S蛋白受体结合区的SARSCov S1蛋白片段S1c(N端249～667 aa),得到特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249～667的mAb,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。从目前已测序的SARSCoV的基因序列来看，新的毒株和已知的人呼吸道病毒的同源性达50％～60％，因此针对SARSCoV的特有抗原表位的抗体，对于SARSCoV的研究有重要意义。本研究首次报道的S1m蛋白（N端613～1 256 aa）是否是针对SARSCoV的特有抗原表位，获得的抗SARSCoV S1m蛋白特异性mAb是否是抗特有抗原表位的抗体，也值得我们深入研究。

本实验室成功获得了重组蛋白S1m的表达，用纯化的重组蛋白S1m作为免疫原，经过细胞融合和亚克隆,获得了1 株能稳定分泌抗S1m蛋白mAb的杂交瘤细胞1H2,获得的腹水效价高。Western blotting及间接ELISA分析显示mAb1H2的特异性好。经ELISA检测，mAb1H2与20例正常献血者血清无反应。该单克隆抗体对SARS的早期诊断、预防及研究S蛋白功能中的应用价值有待进一步探讨。

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