内容
作者：崔少千,范广宇,李建军,周凤华,于洪德,张磊,李雷,王欢 作者单位：1.中国医科大学附属盛京医院脊柱创伤外科,辽宁沈阳 2.中国医科大学附属第一医院 骨科,辽宁沈阳
【摘要】 目的： 用骨形态发生蛋白2(BMP2)腺病毒表达载体(AdBMP2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响。方法： 用AdBMP2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP2的表达。流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响。酶标法检测ALP活性；免疫荧光检测骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响。结果： BMP2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP2蛋白阳性表达。流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异。ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质。结论： 在腺病毒载体介导下BMP2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化。
【关键词】 腺病毒；骨形态发生蛋白2；骨髓基质干细胞；基因治疗
BMP2是最主要的骨形成调控因子之一,在体内和体外能够诱导干细胞分化和骨形成。骨组织工程中应用缓释技术将BMP2加入载体的方法虽然取得了一些成果,但从理论到技术均有尚不完善之处。本实验采用体外基因治疗策略,将携带BMP2基因的重组缺陷型腺病毒表达载体（AdBMP2）转染骨髓基质干细胞(BMSCs),检测BMP2基因表达，观察基因转染对BMSCs增殖及成骨分化的影响,探讨其作为内源性BMP2的“生物发生器”以及骨组织工程种子细胞的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 腺病毒载体及细胞 AdBMP2、携带β半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（AdLacz）和人胚肾293细胞,由中国医科大学附属盛京医院骨科李建军博士提供。通过感染293 细胞扩增病毒,测定AdBMP2滴度为2×1010 PFU·ml-1。
1.1.2 实验动物 新西兰大耳白兔,雌雄不限,体质量2.0～2.5kg,由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供,许可证号：SCXK（辽2003-0013）。
1.1.3 主要试剂 DMEM细胞培养基（北京海克隆生物制品有限公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品有限公司）；BMP2单克隆抗体、原位杂交检测试剂盒和免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；骨钙素、Ⅰ型胶原单克隆抗体（Santa Crus公司）；二抗FITC标记IgG（北京中杉金桥）；Xgal（大连宝生物公司）;碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。
1.1.4 主要仪器 垂直电泳仪（BioRad）；转印电泳仪（Amersham公司）；可调温摇床（哈尔滨东联公司）；台式低温离心机（Eppendorf公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（芬兰雷勃集团MK3）；荧光显微镜（日本 Olympus）。
1.2 方法
1.2.1 兔骨髓基质干细胞培养及转染 用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs,2周左右贴壁细胞基本长满单层,即得到原代培养细胞。按1∶3或1∶4比例分瓶传代培养。BMSCs（P2）长至基本融合时,更换成含2%FBS的DMEM培养液,细胞计数,根据病毒滴度按感染倍数（MOI）为100（即1个细胞用100个病毒颗粒感染）加入相应体积的AdBMP2,过夜。次日换成含10%FBS的DMEM正常培养液培养2 d。同等条件下AdLacz转染细胞（MOI=100）,Xgal免疫染色检测转染效率。实验组：AdBMP2转染；实验对照组：AdLacz转染；空白对照组：未转染。
1.2.2 原位杂交、免疫细胞化学染色检测细胞内BMP2基因表达 取各组细胞,以1×105 ml-1的密度接种于多聚L赖氨酸处理过的盖玻片上,待贴壁细胞密度达到50%左右时取出盖玻片,PBS漂洗3次,4％多聚甲醛固定。分别按BMP2原位杂交、免疫组化试剂盒操作步骤进行操作,DAB显色,苏木素复染,透明,封片,光镜观察。
1.2.3 Western blotting检测培养液中BMP2蛋白 各组细胞换无血清培养液孵育12h,收集培养液20ml,冻干机冻干后加入50μl上样缓冲液。取10μl样品,煮沸5min,离心5min,上清以12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（12%SDSPAGE）分离。SDSPAGE电泳在恒压条件下进行,浓缩胶中为120V,分离胶中为160V。常规转膜,封闭,然后按膜面积计算一抗用量（0.1ml·cm-2）,使用Tween 20PBS按比例稀释一抗（BMP2单克隆抗体）,与滤膜4℃温浴3h；以TPBS按比例稀释二抗（辣根酶标记抗体）,与滤膜室温温浴1h；加入生色底物溶液（PBS 9ml+二氨基联苯胺9mg+0.3%LiCl2 1ml,最后加入H2O2至0.14%）,室温摇动观察条带颜色清晰,PBS终止显色反应,洗涤,干燥,避光保存。rhBMP2标准蛋白20ng作为阳性对照组。
1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期 每组细胞各取6 瓶（1×106瓶-1）,胰酶消化收集细胞,用1ml PBS制成单细胞悬液,加入75%冰乙醇4ml固定12h,100μg·ml-1碘化丙啶避光染色30min,震荡混匀,上机检测,联机软件测定分析细胞周期各时相比例,数据采用SPSS统计软件处理,方差分析比较。
1.2.5 ALP活性检测 每组细胞弃去培养液,加100μl 2％Triton100,4℃过夜,按ALP活性检测试剂盒说明操作,测定吸光度,计算酶活性值。同时设空白对照。计算均数,组间差异用 t 检验行统计学分析。
1.2.6 免疫荧光检测骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原表达 将各组细胞接种于预置有盖玻片的6孔板内,2周后取出玻片,PBS漂洗3次,4％多聚甲醛固定。免疫荧光法分别检测OCN、Ⅰ型胶原表达,0.2% Triton X100透化处理,10% BSA室温封闭,一抗4℃湿盒孵育过夜,二抗FITC标记IgG室温避光孵育2 h,PBS漂洗3次,95%甘油封片,荧光显微镜下观察实验结果。
2 结 果
2.1 AdBMP2转染BMSCs及转染率检测
转染后细胞形态无明显变化,边界清晰,生长旺盛,细胞核较大,呈圆形或椭圆形,胞浆中颗粒较多,随培养时间延长多角型细胞增多。AdLacz转染后,细胞可编码产生β半乳糖酐酶,作用于生色底物Xgal,反应产物呈蓝色。与AdBMP2转染同等实验条件下（MOI=100）,腺病毒转染效率高达90%以上（图 1）。
2.2 BMP2基因在BMSCs内的表达
原位杂交及免疫细胞化学染色均显示实验组细胞质中有较多棕黄色强阳性染色颗粒（图 2、3）,而实验对照及空白对照组则为阴性。结果表明：AdBMP2转染的BMSCs中BMP2基因在mRNA和蛋白水平均呈高效表达。
2.3 Western blotting检测培养液中BMP2蛋白
Western blotting检测显示AdBMP2转染组有BMP2强阳性条带,AdLacz转染组和未转染组为弱阳性条带。AdBMP2转染BMSCs后,分泌的BMP2蛋白含量远高于实验及空白对照组（图 4）。结果表明：AdBMP2转染的BMSCs中分泌性BMP2蛋白高效表达。
2.4 流式细胞仪检测细胞周期
分析细胞周期结果显示,实验组与实验对照组及空白对照组的G1期、S期细胞比例无显著差异（P 0.05），表明AdBMP2转染后,BMSCs的DNA合成以及细胞的增殖未因转染受影响(见表1)。表1 细胞周期流式细胞仪分析结果 AdBMP2转染组ALP活性为(30.21±1.85) U·ml-1,AdLacz转染组为(19.56±2.09) U·ml-1,未转染组为(20.65±1.93) U·ml-1,经 t 检验分析,AdBMP2转染细胞组ALP活性较实验对照组及空白对照组明显增高,差异有显著性（P﹤0.01）。
2.6 免疫荧光检测OCN、Ⅰ型胶原表达
AdBMP2转染细胞的胞浆内有大量阳性绿色荧光物质（图5、6）,而实验对照组及空白对照组细胞均为阴性。结果表明，AdBMP2转染后,细胞内有骨钙素、Ⅰ型胶原的高效表达,提示BMSCs向成骨细胞表型分化。
3 讨 论
BMSCs因其取材方便,易于分离,体外增殖能力强,具有多方向分化潜能,经诱导可成骨分化,是目前骨组织工程中应用最为广泛的种子细胞。研究表明,单纯BMSCs作为种子细胞向成骨分化过程较慢,并非是一个自发的过程,需要细胞因子及特定的体内环境作用,而且成骨分化后细胞表型的维持也需要细胞因子的作用［1］。体内移植后早期细胞外基质形成不足时,植入的细胞也会失去依托和紧密的细胞间黏附,局部的成骨微环境形成将受到阻碍,不能及早确立优势成骨细胞群而将阻碍成骨。本实验中也观察到 BMSCs的ALP活性较低,OCN、Ⅰ型胶原含量少,提示成骨活性较弱。因此，BMSCs需经改造以增强成骨活性才能成为理想的种子细胞。
图 6 Ⅰ型胶原免疫荧光（×100）
BMP2是被公认最强的成骨诱导因子之一,是调控BMSCs向成骨方向定向分化的主要因子,而且已开始应用于临床［2］。但BMP2的制备过程复杂,产量低；活性不稳定,在体内环境代谢快,骨诱导时间短；作为外源性蛋白植入体内,用量大时可能会产生毒性反应,还可能引起免疫排斥反应［3］；有报道致力于采用缓释技术来解决这些缺陷,然而支架材料中能否整合足够量的BMP2并持续稳定释放,而且BMP2对理化处理是高度敏感的,在支架材料中能否保持生物活性,成为难以解决的问题［4］。应用基因治疗技术可将成骨诱导因子的目的基因导入靶细胞,经过基因修饰的细胞可持续表达细胞因子,可在局部根据需要持续、稳定、靶向释放内源性细胞因子,促进成骨,并起到维持成骨细胞表型的作用,克服直接应用外源性细胞因子可能产生的上述缺点。
重组复制缺陷型腺病毒因其毒性低、靶细胞范围广泛、转染率高、不与靶细胞发生基因整合等优点,成为基因治疗中常用的载体之一。本研究在重组缺陷型腺病毒载体介导下将BMP2基因导入BMSCs,与实验对照组比较,AdBMP2转染的BMSCs中BMP2基因在mRNA及蛋白水平呈高效表达,培养液中BMP2含量较高。而且观察到AdBMP2转染的BMSCs中ALP活性增强,OCN、Ⅰ型胶原呈阳性表达。ALP活性被认为是衡量BMSCs向成骨细胞方向分化程度和成骨细胞功能状态的一个重要指标［5］。Ⅰ型胶原蛋白主要由成熟的成骨细胞合成分泌,是成骨细胞的重要标志物之一［6］。OCN是骨代谢细胞分化成熟、处于功能状态的标志［7］。因此根据实验结果可以认为,BMP2基因修饰的BMSCs向成骨细胞表型分化,提示BMP2基因的转染使BMSCs高效表达、分泌的内源性BMP2,通过自分泌或旁分泌增强了自身的成骨活性。BMP2促进BMSCs向成骨细胞分化的机理还不十分清楚,目前认为BMP2并不直接作用于靶基因,而是通过BMP2、受体、信号途径和靶基因组成的一个较完整的信号系统发挥成骨诱导作用,BMP2处于系统的核心和启位点［8］。
细胞分化与增殖的矛盾是细胞生物学特征之一,即分化低的细胞增殖能力强,分化高的细胞增殖能力差。本实验观察到AdBMP2转染BMSCs促进了其向成骨细胞的定向分化,但通过流式细胞仪检测分析细胞周期的结果显示，AdBMP2转染的BMSCs的增殖能力并未受影响,与未转染细胞无差异,倒置显微镜观察细胞生长情况也证实了这一点。考虑除了与BMSCs强大的增殖能力有关外,可能还与BMP2对BMSCs增殖有促进作用有关。
综上所述,采用基因技术,通过重组复制缺陷型腺病毒载体介导,可将BMP2基因高效导入BMSCs,基因转染的BMSCs不仅提供了内源性BMP2的局部来源,而且提供了BMP2自身效应的靶细胞,实现了向成骨细胞的定向分化并保持了强大的增殖能力,有望成为骨组织工程中比较理想的种子细胞。至于基因转染的BMSCs能否在局部根据需要持续、稳定释放内源性BMP2，植入体内的转归，以及腺病毒载体的安全性等问题尚需进一步研究。
【参考文献】
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