内容
作者：江红秀，韩国荣,吴引伟,张永成 作者单位：1.东南大学 临床医学院，江苏 南京； 2.东南大学附属南京第二医院 妇产科，江苏 南京； 3.东南大学附属南京第二医院 检验科，江苏 南京
【摘要】 目的： 探讨白细胞介素6（IL6）mRNA在HBV感染胎盘中的表达情况。方法： 临床上选取HBsAg(+)且HBV DNA（1～3）×108copies·ml-1孕妇60例,应用免疫组化SP方法检测其胎盘上HBsAg、HBcAg,根据HBsAg和（或）HBcAg是否表达分为胎盘感染组及非感染组,应用ELISA及RTPCR方法检测两组孕妇分娩前血清IL6水平及分娩时胎盘IL6 mRNA表达。结果： 胎盘感染组42例,非感染组18例。胎盘感染组宫内感染率15/42(35.7%),非感染组宫内感染率1/18(5.56%),两组之间有显著性差异（χ2=4.38,P＜0.05）。胎盘感染组胎盘局部IL6 mRNA表达明显高于非感染组,差异有统计学意义（P＜0.05）。两组血清IL6水平无统计学差异（P＞0.05）。结论： 胎盘感染是HBV宫内感染的危险因素,胎盘局部IL6表达与胎盘HBV感染可能有一定的相关性。
【关键词】 乙型肝炎病毒；白细胞介素6；胎盘感染；宫内感染
近年来,多项研究[1]证实胎盘乙型肝炎病毒（HBV）感染是乙型肝炎（乙肝）宫内感染主要机制之一,而其具体机制目前尚未清楚。有研究表明[2],白细胞介素6（IL6）能够介导HBV对细胞的感染,并在一定程度上促进HBV的感染及复制,但关于IL6与胎盘HBV感染之间的关系及其在宫内感染中的作用,目前研究尚少。本实验通过检测HBV胎盘感染与孕妇血清IL6水平及胎盘局部IL6 mRNA表达之间的关系,从而为乙肝宫内传播机制的探讨提供一条途径和思路。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择2007年3月至2008年1月在东南大学附属南京第二医院妇产科门诊产前检查HBsAg阳性且HBV DNA在（1～3）×108copies·ml-1的孕妇60例。所选病例肝肾功能正常,无先兆早产及先兆流产史,无其它感染性疾病、传染性疾病、妊娠合并症及并发症,三维B超排除胎儿畸形,丈夫为非HBV携带者或乙肝患者,产前统一注射高效价乙肝免疫球蛋白进行阻断治疗且未进行抗病毒治疗者。根据胎盘是否表达HBsAg和（或）HBcAg分为胎盘感染组及非感染组,两组孕妇年龄、孕产次、分娩方式及HBV DNA量无明显差异。60例孕妇共分娩新生儿60名。
1.2 标本的收集与处理
采集足月孕妇分娩前新鲜血清约200μl,-70℃迅速保存。无菌取顺产或剖宫产孕妇胎盘母体面中央（避开钙化或坏死部分）大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm胎盘组织,用0.9％NaCl漂洗干净后放入用DEPC水处理过的无菌EP管中-70℃冷冻保存。同时无菌采集1.5cm×1.5cm×2.0cm大小胎盘,包括母面至胎儿面各层,立即置于4％多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,制成4～5μm切片备检。
1.3 方法
1.3.1 孕妇及新生儿血清乙肝两对半（HBVM）及HBV DNA定量检测 孕妇入院及新生儿出生后立即常规检测血清HBV DNA和HBVM。新生儿１个月时检测HBVM。HBVM采用化学发光法（Abott法）进行检测,HBV DNA定量采用荧光定量PCR方法,检测工作由东南大学附属南京第二医院检验科完成。
1.3.2 胎盘组织HBsAg及HBcAg的检测 采用免疫组化SP法,鼠抗人 HBsAg、HBcAg及免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。操作严格按照说明书进行,同时设立阴、阳性对照。 正常阴性对照：为血清乙肝标志物及HBV DNA阴性的正常孕妇胎盘；空白对照：不加第一抗体,代之以抗体稀释液。阳性对照：HBsAg及HBcAg阳性肝组织切片。
1.3.3 血清IL6的ELISA检测 ELISA试剂盒购自Ebioscience公司,具体实验步骤按照试剂盒说明进行操作。
1.3.4 RTPCR检测胎盘组织IL6mRNA 组织RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司,RTPCR试剂盒购自Shpromega公司,合成引物购自南京金思特科技有限公司。按试剂盒说明书统一提取RNA,进行琼脂糖电泳观察RNA质量,紫外分光光度计测定其浓度及纯度。所用枪头和EP管均经过DEPC水处理以防RNA酶污染。按照说明书具体步骤进行cDNA的第一链合成即逆转录过程，然后进行PCR扩增实验。IL6上游引物为 5′AATAACCACCCCTGACCCAA3′,下游引物为5′GACCAGAAGAAGGAATGCCC3′,扩增产物片断为200bp。内参βactin上游引物为 5′AGCGAGCATCCCCCAAAGTT3′,下游引物为 5′GGGCACGAAGGCTCATCATT3′,扩增片断为 285bp。取PCR扩增产物5μl于1％琼脂糖凝胶上进行电泳,在凝胶成像系统上扫描,并运用相关软件进行分析,测得 IL6和βactin的相对表达量。
1.4 宫内感染标准
胎儿出生后即刻股静脉血HBsAg及HBV DNA任意1项阳性并随访至1个月,如１个月时新生儿HBsAg仍阳性者为HBV宫内感染[3]。
1.5 免疫组化判断及胎盘感染标准
看到细胞膜、细胞质或胞核有棕黄色着色为HBsAg或HBcAg阳性细胞,HBsAg及HBcAg任意１项阳性为胎盘HBV感染。
1.6 统计学处理
采用SPSS 15.0软件对两组间数据进行分析,计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验。
2 结 果
2.1 两组胎盘HBsAg、HBcAg表达情况
在所选60例乙肝高病毒载量的孕妇胎盘中,以HBsAg或HBcAg任１项阳性者为HBV感染。根据此标准胎盘感染者42例,18例胎盘未感染。HBsAg主要位于阳性细胞的细胞质及细胞膜,偶见于细胞核,而HBcAg主要位于细胞核和细胞浆。在胎盘感染中,棕黄色颗粒可见于从母体面到胎儿面的各层细胞,如蜕膜细胞、滋养细胞、绒毛间质细胞及毛细血管内皮细胞,并且阳性率逐层下降，见表1。表1 60例乙肝高病毒载量孕妇胎盘上HBsAg、HBcAg表达情况%表1 60例乙肝高病毒载量孕妇胎盘上 HBsAg、HBcAg表达情况
2.2 两组宫内感染比较
根据宫内感染标准42例胎盘感染组中新生儿宫内感染者15例,宫内感染率为15/42（35.7%）,而胎盘未感染者新生儿宫内感染1例,宫内感染率为1/18（5.56%）,胎盘感染组宫内感染率明显高于未感染组(χ2=4.38,P 0.05)。胎盘感染组宫内感染者毛细血管内皮细胞均阳性,表明胎盘HBV感染及毛细血管内皮细胞HBV感染为胎儿HBV宫内感染危险因素。
2.3 血清IL6水平
胎盘感染组IL6血清水平为(74.25±8.60)pg·ml-1,而胎盘非感染组IL6血清水平为(72.23±6.21)pg·ml-1,两组间无显著性差异（P＞0.05）。
2.4 胎盘IL6 mRNA的RTPCR半定量分析
凝胶电泳结果显示,在200bp处见一特异性条带,在285bp处条带为内参照条带，见图1。
１、３.非感染组IL6 mRNA ＰＣＲ扩增产物； ５、７.感染组 IL6 mRNA PCR扩增产物； ２、４、６、８.βactin； M.DNA相对分子质量
图1 胎盘感染组及非感染组IL6 mRNA表达情况
以βactin为内参照进行半定量分析,胎盘感染组IL6 mRNA的灰度比值为2.89±0.63，明显高于未感染组的1.70±0.45,两组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨 论
3.1 胎盘感染是HBV宫内感染的危险因素
胎盘是母胎之间的屏障,对病原微生物有一定的防御作用,高病毒载量的乙肝孕妇胎盘绒毛周围充斥着含有大量病毒的血液,病毒可通过感染胎盘从而传给胎儿。现有大量研究证实胎盘HBV感染是HBV宫内感染的主要机制之一。王素萍等[4]研究表明，胎盘感染是HBV宫内感染的危险因素。在本研究中选取60例HBVDNA含量为(1～3)×108copies·ml-1孕妇,60例孕妇当中胎盘感染者42例,非感染者18例,两组孕妇携带HBVDNA含量无明显差异,均衡性较好,但胎盘感染组新生儿宫内感染率35.7%,明显高于胎盘非感染组5.55%,从而说明胎盘感染者能增加HBV宫内感染的几率,表明胎盘感染是HBV宫内感染的危险因素。本结果显示,胎盘HBV细胞感染率从母体面到胎儿面逐渐下降,且18例毛细血管内皮细胞感染者有15例发生HBV宫内感染。说明胎盘有一定的屏障作用,但胎盘感染者并非一定发生HBV宫内感染,随着感染细胞层次的深入，HBV宫内感染危险增加。闫永平等[1]研究表明，胎盘上有HBV相关抗原及HBV DNA表达,经胎盘细胞转移,从胎盘母体面到胎儿面HBV感染率逐渐下降,与宫内感染之间的危险性逐渐升高。在关于胎盘如何感染HBV发生宫内感染,有人认为是先兆流产和先兆早产等因素使胎盘损伤导致母血进入胎儿血循环使胎儿感染,即胎盘渗漏。后有人认为病毒通过胎盘各层细胞上的相关受体逐层感染从而感染胎儿,但其如何通过胎盘途径及具体是何种因子介导目前尚未阐明。
3.2 IL6在HBV胎盘感染中的作用
有关资料表明［56］,乙型肝炎病毒X基因所编码的HBX蛋白可以通过激活IL6转录因子,增加IL6的表达,而IL6反过来可以通过信号转导途径增强乙型肝炎病毒增强子1的活性,促进乙型肝炎病毒HBX蛋白的表达及病毒复制,即IL6表达与HBV感染之间有相互促进关系。
本研究按胎盘是否表达HBsAg和（或）HBcAg抗原分为胎盘感染组和非感染组,两组胎盘血清IL6总体水平无统计学差异,但胎盘局部IL6 mRNA表达胎盘感染组明显高于非感染组。此研究表明，血清IL6水平与胎盘感染无明显相关性,而胎盘局部的IL6表达与胎盘HBV感染有一定相关性。IL6是细胞因子网络成员组成之一,来源于单核巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及Th2淋巴细胞等多种细胞,IL6受体分布广泛,提示IL6可能具有多种生物活性,如免疫调节、防御作用、急性期反应等。妇女正常妊娠时,体内激素水平发生巨大改变,在大量分泌的孕酮、雌二醇、糖皮质激素等激素的作用下,体内和母胎局部的免疫因子以Th2分泌的细胞因子占优势 [78],Th1细胞所介导的免疫反应受到一定程度的抑制。胎盘合体滋养细胞可分泌IL6且表达IL6R,IL6是影响滋养细胞功能的一个关键因子,在滋养细胞的增殖、入侵及分化中起重要作用[9],而滋养细胞的分化有利于病毒的感染及复制，推测IL6可能通过促进滋养细胞的分化从而促进胎盘HBV感染。
虽然目前关于IL6在HBV感染中的具体作用不太清楚,但在研究是否有些细胞因子参与乙肝病毒的pres1与细胞的相互作用的实验中表明,IL6可介导HBV吸附于细胞受体[10]，并在体内外均促进HBV感染细胞[2]。本研究中胎盘感染组的局部IL6 mRNA表达高于非感染组,说明IL6可能促进胎盘的HBV感染，从而增加胎儿HBV宫内感染的几率。
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