内容
作者：李建立,赵砚丽,李喜龙,赵志勇,刘晓明,闫志军 作者单位：河北省人民医院,1.麻醉科;2.心脏外科,河北 石家庄,050051
【摘要】 目的 观察乌司他丁对体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)患者中性粒细胞( PMN)核因子κB (NF-κB)活性及血浆中TNF-a和IL-8水平的影响。方法 选择在体外循环下行心脏直视手术的法洛四联症患儿40例，随机分成乌司他丁组(U组)和对照组(C组),每组20例。U 组于麻醉诱导后给予乌司他丁，C组患者则给予等容积的生理盐水代替。分别于麻醉后手术前(T1)、CPB开始后30 min(T2)、CPB停止后30 min(T3)、CPB停止后4 h(T4)和CPB停止后24 h(T5)抽血，应用ELISA法检测NF-κB活性及血浆中TNF-a和IL-8水平。结果 两组PMN NF-κB 活性在CPB开始后逐渐升高,T3时达到峰值, 之后逐渐下降，但在T5时点依然高于术前水平; U组在T2、T3、T4、T5时点 PMN NF-κB活性均低于C组(P 0. 05)。两组TNF-α和IL -8 水平均于手术开始后逐渐升高(P 0.05) , T3达高峰, 之后逐渐下降，在T5时点基本恢复正常; C组TNF-a和IL -8 水平在T3、T4时点均显著高于U组(P 0.05)。U组NF-κB的活性与血浆TNF-α水平呈正相关，相关系数为0.533(P 0.05)；NF-κB的活性与血浆IL - 8水平亦呈正相关，相关系数为0.528(P 0.05)。C组NF -κB的活性与血浆TNF-α、IL- 8水平亦呈正相关，相关系数分别为0.531、0.512( P 0.05)。结论 乌司他丁可以通过降低CPB患者PMN NF - κB活性进而降低血浆TNF-a和IL-8的表达,抑制体外循环后的炎症反应。
【关键词】 乌司他丁; 心肺转流术; 中性粒细胞; 核因子κB；TNF-a；IL-8
Effects of Ulinastatin on NF -κB Activity of Polymorphonuclear Neutrophils，
TNF-a and IL-8 in Patients Undergoing Cardiopulmonary Bypass
LI Jian-li,ZHAO Yan-li,LI Xi-long,ZHAO Zhi-yong,LIU Xiao-ming,YAN Zhi-jun
(The Hebei General Hospital, Hebei Shi jia zhuang , 050051，China )
Abstract: OBJECTIVE To study the effects of ulinastatin on the NF -κB activity of polymorphonuclear neutrophils，TNF-a and IL-8 expression in the patients underwent cardiopulmonary bypass (CPB).METHODS Forty tetralogy of Fallot patients were randomly divided into two groups of 20 each, control group(C) and ulinastatin group (U). 5 ml blood sample took from radial artery after induction of anesthesia (T1), 30 min after CPB (T2), 30 min (T3), 4 hours (T4) and 24 hours (5) after came off CPB. NF -κB activity was tested in ELISA and expression of TNF-a and IL-8 was measured in ELISA also.RESULTS The value of NF-κB activity showed a progressive rise after starting CPB，the peak level of NF-κB activity shown at T3，then it decreased. The NF- κB activity in T2,T3,T4 and T5 of treatment group was lower than that in control group. Expression of TNF-a and IL-8 showed a progressive increase in two groups at all the 5 time points in the clinical study. The TNF-a and IL-8 expression in treatment group was lower than that in T2,T3,T4 and T5 of control group. There were significantly positive correlation among the activation of NF-κB, and serum level of TNF-αor IL-8 in both the ulinastatin group and control group (P 0.05).CONCLUSION ulinastatin can reduce the activity of NF- κB and then reduce the expression of TNF-a and IL-8. ulinastatin can inhibit inflammatory reaction during CPB.
Key words： Ulinastatin ; Cardioplumonary bypass; Polymorphonuclear neutrophils; NF-κB ; TNF-a；IL-8
体外循环(cardioplumonary bypass,CPB)可触发一系列全身炎症反应( SIRS) , CPB中许多因素如血液与人工装置非生物表面直接接触,手术创伤,器官缺血再灌注,术中体温的改变等,均可引起全身炎症反应［1］,引起促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha , TNF-α) 、白细胞介素-6 (interleuk in-6 , IL-6) 、白细胞介素-8 (interleukin-8 , IL-8)释放,导致组织损伤。核因子κB ( nuclear factor -κB,NF-κB)是多种细胞因子和炎症介质的基因转录和级联放大过程的共同通路和作用位点,该基因序列的活化可加重CPB 及心脏缺血再灌注损伤中的炎症反应程度［2］ 。乌司他丁(ulinastatin) 为广谱的蛋白水解酶抑制剂,具有抑制炎性介质产生的作用。但乌司他丁对CPB患者NF- κB活性是否有影响及其抑制炎症反应的作用是否是通过抑制NF-κB活性进而抑制炎症因子释放还不清楚，我们旨在探讨乌司他丁对心内直视手术患者NF-κB活性和促炎性细胞因子TNF-α、IL-8 的影响及它们之间的关系。
1 资料与方法
1.1 病例选择与分组 选择心功能Ⅲ-Ⅳ 级、择期CPB下行法洛四联症根治术患者40例。随机分为对照组(C 组) 和乌司他丁组(U 组) ,每组20 例。所有患者均无肝肾功能障碍、糖尿病、重度贫血及近期使用皮质激素治疗等。
1.2 麻醉及CPB方法 全部病例均于术前30 min肌注吗啡0.1 mg/kg,东莨菪碱0.01 mg/kg,麻醉诱导为芬太尼5μg/kg,咪唑安定0.15 mg/kg,万可松1. 5 mg/kg,气管插管全身麻醉,麻醉维持应用芬太尼25～30μg/kg,间断应用万可松、异丙酚或异氟烷吸入麻醉。CPB均采用Sarns - 8000 人工心肺机,希健-Ⅰ型膜式氧合器和科威- 87微栓过滤器。万汶、浓缩红细胞等预充,晶胶比1∶0. 6～0. 8。转机前常规肝素化( 3 mg/kg) , CPB中追加肝素抗凝,保持ACT 480 s。动脉流量80 ～120ml/ ( kg·min) ,术中维持血压40～60 mmHg(1 mmHg = 0. 133kPa) 。血液中度稀释,中度降温。St. Thomas液间断灌注心脏。停机后按1∶1用量以鱼精蛋白中和体内肝素。
1.3 用药方法、标本采集及指标测定 U 组于麻醉诱导后切皮前给予乌司他丁(广东天普生物化学制药有限公司,每支5万U) 以10 000 U/kg 的剂量先一半缓慢静脉泵注 ,另一半加入预充液中,经转机进入体内。C 组以等容生理盐水（NS）代替。两组分别于麻醉诱导后(T1) 、CPB开始后30 min (T2) 、CPB停止后30 min (T3) 、4 h (T4) 、24 h (T5) 各时点抽桡动脉血5 ml ,肝素抗凝(肝素化血不抗凝)，测定红细胞比积，即刻分离血浆和中性粒细胞（密度梯度离心法）并于- 70 ℃以下贮存待测。用ELISA法（试剂盒购自CST公司）测定中性粒细胞( PMN)核因子κB (NF-κB)活性和血浆TNFa、IL-8的水平。由于CPB期间血液稀释因素, 所得数值由Hct值按如下公式进行校正:
校正值=测得值×( CPB前Hct值/Hct测得值)
1.4 统计学处理 所有数据均以均数±标准差( ±s )表示。应用SPSS11. 0 统计软件进行统计分析,组内比较采用重复测量数据的方差分析,组间比较采用配对t检验, P 0. 05认为差异有统计学意义。 组内NF - κB 活性与血浆TNF-α、IL-8水平进行Pearson相关分析。
2 结 果
2.1 两组患者一般资料比较无统计学差异(P 0.05)，见表1。
2.2 两组患者PMN NF - κB 活性在CPB开始后逐渐升高,CPB停止后30 min达到峰值,然后呈下降趋势，但在CPB停止后24h依然高于术前水平；U组NF -κB 活性在CPB开始后30 min、CPB停止后30 min、4 h、24 h PMN NF -κB活性均低于C组(P 0. 05) ,差异有统计学意义，见表2。
2.3 两组术后TNF-α和IL -8 水平均比术前明显升高(P 0.05) , CPB停止后30 min达高峰, 之后逐渐下降。两组TNF-α和IL -8 水平在术后24 h 后基本恢复正常。C组TNF-a和IL -8 水平在CPB停止后30 min、4 h 均显著高于U组(P 0.05)，见表2。
2.4 U组NF-κB的活性与血浆TNF-α水平表1 病例分组及一般资料比较2 两组患者不同时点PMN NF -κB活性及血浆TNF-a、IL-8 水平的比较注：与T1相比, #P 0.05, ##P＜0.01; 与C组相比, ▲P 0.05, ▲▲P 0.01
呈正相关，相关系数为0.533(P 0.05)；NF -κB的活性与血浆IL- 8水平亦呈正相关，相关系数为0.528(P 0.05)；C组NF -κB的活性与血浆TNF -α呈正相关，相关系数为0.531(P 0.05)；NF -κB的活性与血浆IL - 8水平亦呈正相关，相关系数为0.512(P 0.05)。
3 讨 论
目前多认为CPB 引起的全身炎症反应是导致CPB 术后组织、器官损伤的重要因素。CPB 期间,血液与人工装置非生物表面的接触促发TNF -α、IL - 6、IL - 8、IL - 10 等多种炎症介质的瀑布样释放,导致全身炎症反应,并引起组织损伤和器官功能障碍 。
乌司他丁是一种典型的Kuniz 型的蛋白酶抑制剂,具有两个活性功能区。两个活性功能区均有广谱抑酶作用, 且不完全重叠, 能够同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A 2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种蛋白酶的活性［3］。乌司他丁降解形成的分子产物仍对上述各种蛋白酶有高效抑制作用, 能改善休克时的微循环状态, 对溶酶体膜有稳定作用。乌司他丁还可抑制炎症介质释放, 预防细胞因子级联反应, 抑制白细胞过度激活及炎症介质的释放, 阻断细胞因子、炎症介质与白细胞之间的恶性循环, 减轻上述各种蛋白酶对机体组织器官功能的损伤作用［4］。
TNF-a主要由激活的巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞及B 淋巴细胞分泌, 在炎症过程中具有启动和触发作用, 可直接损伤血管内皮细胞, 激活多形核粒细胞产生多种活性物质, 导致组织器官损伤。IL-8由TNF-a、IL -1 等因子激活的单核巨噬细胞、内皮细胞分泌, 对中性粒细胞有趋化作用, 可刺激中性粒细胞脱颗粒, 也可导致溶酶体酶释放及氧自由基产生,加重脏器的损害。［5］ 因此, 本实验选择TNF-a和 IL-8作为反映炎症反应强弱的指标。本实验显示两组转机后TNF-α和IL -8 水平均比术前明显升高，于CPB停止后30分钟达峰值,之后呈逐渐下降趋势,但直到停机后24 h二者依然高于术前水平,说明体外循环确实可引起炎症因子释放，这也与临床所观察到的严重炎症反应多见于CPB术后4～24 h基本一致，其机制与血液与人工装置非生物表面的接触及缺血- 再灌注损伤有关。［6］而C组TNF-a和IL -8 水平在CPB停止后30 min、4 h 均显著高于U组。说明体外循环中使用乌司他丁确实可以抑制炎症因子的释放，减轻CPB所致的炎症反应，这一结果与Sato Y等［7］的研究结果相符合。乌司他丁减少这些促炎性细胞因子的释放可能与以下因素有关：抑制肥大细胞介质的释放，可能是因为它减少了生物脂质膜的流动性，并打断了受体和效应器官的结合从而减少了介质的释放。稳定溶酶体膜，抑制众多酶活性,抑制粒细胞弹性蛋白酶和细胞自溶素G 阻止中性粒细胞，单核粒细胞和巨嗜细胞聚集，抑制过量超氧化物生成以及清除产生的超氧化物等，从而保护多器官免受损害［8-10］。
NF-κB 是具有基因转录调节作用的蛋白质因子,几乎存在于所有细胞中,调节着编码细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞粘附分子和一些有关健康及疾病的蛋白基因，广泛参与多种细胞因子和炎症介质的基因转录和级联放大过程。［2］通常情况下 NF-κB与其抑制因子-κB（I-κB）结合以无活性形式存在于细胞浆中, 潜伏形式的 NF-κB可被多种诱导物激活, 进入核内与相应的靶基因结合, 发挥转录调节作用, 广泛参与多种生理或病理过程。而体外循环炎症反应的病理生理过程中产生的重要的细胞因子如IL - 1、IL - 2、IL - 8、IL - 10、TNF -α等又可作用于IκB 蛋白激酶(IKK) ,影响IκB -α的磷酸化降解,加速NF-κB的活化; NF -κB活化后易位入核又通过诱导靶基因,加快这些炎性因子的转录［4］ 。我们同时检测了对照组和乌司他丁组患者PMN NF -κB的表达活性,结果显示两组患者随着CPB的启动而PMN NF - κB活性增高,并于CPB停止后30min 达到峰值, 说明随着CPB的启动,引发了一系列的级联反应，促进了PMN中的NF -κB活化、转移入核。其机制可能为:(1）CPB 时补体激活, 产生促炎因子TNF-α、IL - 8，加速NF - κB的活化。(2)缺血再灌注损伤产生大量氧自由基均激活NF-κB，氧自由基已经被阐明可直接作为NF-κB 激活的第二信使 。实验结果显示，U组各时间点NF- κB活性明显低于C组，说明乌司他丁具有降低NF-κB活性，减少其活化，进而减轻炎症因子释放的作用。其机制可能为乌司他丁通过抑制NIK(NF-κB 依赖性蛋白激酶) 激活IKK( IKB 蛋白激酶) 而抑制NF -κB的活化；也可能为乌司他丁通过抑制TNF - α、IL- 8 的过量释放而降低NF -κB的活化进而降低NF-κB造成的多种炎症介质的瀑布样释放，即降低三者之间的正反馈过程，从而减轻体外循环所致的炎症反应。
同时,我们对NF-κB的活性与血浆TNF -α、IL-8的水平行Pearson相关分析，U组和C组NF -κB的活性与血浆TNF-α水平呈正相关，与IL-8的水平也呈正相关，说明NF-κB的活性增强可引起炎症因子释放增多，加重炎症反应，同理抑制其活化就可降低炎症反应。本实验研究结果提示乌司他丁可降低体外循环手术病人中性粒细胞NF-κB的活性，并通过抑制NF-κB活性使TNF -α、IL-8表达下调，减轻CPB导致的炎症反应。
【参考文献】
［1］ 倪海峰，肖颖彬. 还原谷胱甘肽对体外循环中性粒细胞激活的干预作用［J］.中国胸心血管外科临床杂志，2003，10 (4): 260-263.
［2］ 尹光明,喻田,余志豪. 核因子kappa B与体外循环炎性反应［J］. 国外医学麻醉学与复苏分册,2004, 25 (6): 353 - 356.
［3］ PugiaMJ, Takemura T, Kuwajima S, et al.Clinical utility of a rap idtest for uristatin［J］.Clin Biochem, 2002, 35 (2): 1052-1101.
［4］ 旷昕,黄艳.乌司他丁对体外循环心脏病人血浆TNF -α、IL - 6 和 IL - 8 的影响［J］.中国医学工程,2004,12(5):26 - 28.
［5］ Hsu LC. Current concepts on the adult respiratory distress syndrome［J］. J Cardiothorac VascAnesth,1997,11(2):376 - 378.
［6］ Asimakopoulos G, Smith PL, Ratnatunga CP,et al. Lung injury and acute respiratory distresssyndrome after cardiopulmonary bypass［J］.Ann Thorac Surg,1999,68(3):1107 - 1115.
［7］ Sato Y, Ishikawa S,Otaki A , et al. Induction of acute phase reactivesubstances during open heart surgery and efficacy of ulinastatin . Inhibiting cytokines and postoperative organ injury［J］ . Jpn J Thorac Cardiovasc Surg, 2000, 48 (7): 428-434.
［8］ Yano T,Anraku S, Nakayama R,et al. Neurop r otectiveeffect of urinary tryp sin inhibit or against focal cerebral ischemiareperfusi on injury in rats［J］. Anesthesiology,2003, 98 (2): 465 - 473.
［9］ 杨雁灵,徐小平,窦科峰,等. 乌司他丁对大鼠胰性脑病保护作用的实验研究［J］. 西北国防医学杂志,2004, 25 (1): 19 - 21 .
［10］ 潘成,虞惠康,罗月娥.注射用乌司他丁［J］. 中国新药杂志, 2000, 9 (2): 123 - 124 .