内容
作者：刘宁宁，孙立忠，郑军，田良鑫，龙 村 作者单位：中国医学科学院，中国协和医科大学，阜外心血管病医院，1.外科；2.体外循环科，北京 100037
【摘要】 目的 运用微透析技术观察猪深低温停循环过程中脊髓神经细胞间液中的各种物质变化，探讨脊髓损伤的分子机制。方法 6只小型香猪，于腰2段脊髓中植入微透析针。建立体外循环，并行循环降温30 min至直肠温度为20℃，停循环60 min，复温和并行循环120 min。在固定时间点采集微透析样本，检测氨基酸和能量代谢物质含量，观察变化趋势。结果 停循环期间丙酮酸明显降低，乳酸/丙酮酸比值达到高峰。复温后葡萄糖、乳酸、丙酮酸和甘油显著升高。降温时谷氨酸和γ-氨基丁酸明显升高。天门冬氨酸、牛磺酸和甘氨酸在复温时升高明显。结论 停循环过程中，神经元细胞的能量代谢被明显抑制。复温中能量代谢率有所恢复，细胞处于高糖、高乳酸的环境中。降温时谷氨酸和γ-氨基丁酸升高，复温中天门冬氨酸、甘氨酸和牛磺酸均显著升高，可能与脊髓损伤有关。
【关键词】 脊髓损伤；深低温停循环；微透析
Microdialysis Study of the Spinal Cord during
Deep Hypothermic Circulatory Arrest in a Porcine Model
LIU Ning-ning1, SUN Li-zhong1，ZHENG jun1, TIAN Liang-xin1, LONG Cun2
(1.Department of Cardiac Surgery；2.Department Cardiopulmonry Bypass,
Cardiovascular Institute and FuWai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100037,China)
Abstract: OBJECTIVE To investigate the changes in energy-related metabolites and the concentration of amino acid in spinal cord during deep hypothermic circulatory arrest. And discuss the mechanism of spinal cord injury. METHODS Microdialysis probe was inserted into the lumbar spinal cord of six pigs respectively. They were cooled to 20℃ by cardiopulmonary bypass (CPB). CPB was established by right atria and aorta cannulation. The rental temperature was cooled to 20℃ by 30 minutes bypass. Then the circulatory arrest was kept for 60 minutes. After 120 min rewarming period pathological changes of lumbar segmental (L2) spinal cord were observed. The concentration of energy-related metabolites and amino acid were examined. RESULTS During the arrest period a decrease of pyruvat level and an increase of the ratio of lactate-pyruvate were observed respectively. Glucose, lactate acid, pyruvat and glycerine concentration was increased significant during reperfusion. Glu and gama-aminobutyric acid(GABA) increased in CPB 30 minute. In the sample taken during the 120 minutes after reperfusion, there were increase in Asp and Tau. The pathological injury of the spinal cord was slightly. CONCLUSION Deep hypothermic reduces the spinal cord energetic metabolism during circulatory arrest. The increase of Glu and GABA in CPB period, Asp, Gly and Tau during reperfusion period may lead to the injury of spinal cord.
Key words： Spinal cord injury; Deep hypothermic circulatory arrest; Microdialysis
深低温停循环（deep hypothemic circulatory arrest, DHCA）被认为是可以有效降低神经系统和内脏缺血损伤的方法。DHCA下行降主动脉的手术不仅可以避免游离主动脉的近心端和在正常主动脉上阻断，还可以在无血的视野中辨认和切除真假腔间的内膜，并减轻器官的缺血损伤［1］。DHCA后脑组织损伤和保护的研究较多，但是脊髓损伤机制的研究在国内外尚属空白。本研究应用先进的微透析技术在分子水平观察降温、停循环和再灌注期间，脊髓细胞间液中各种兴奋性氨基酸和能量代谢产物的变化规律。从而探讨DHCA后脊髓损伤的分子学机制，为脊髓保护提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 实验选用中国小型香猪6只（中国农业大学养殖场），雌雄不限，体重为22～26（23.8±1.7）kg。
1.2麻醉与监护 称重和判断雌雄后，肌注盐酸氯胺酮15 mg/kg行基础麻醉。开放耳缘静脉建立静脉通路。麻醉诱导：氯胺酮10 mg/kg,安定5 mg/kg。气管内插管机械通气，根据动脉血气调整呼吸机参数。麻醉维持：氯胺酮20 mg/(kg·h）, 安定2 mg/(kg·h）, 芬太尼2 μg/(kg·h）。肌松：阿端（哌库溴铵）4 mg/h。术中保证良好的麻醉效果，避免动物的活动对实验的干扰。术中持续监测心电图、直肠温、间断监测动脉血气及电解质。
1.3建立DHCA模型 采用泵前氧合的连接方式，氧合器为膜肺（Trumor Capiox 320）。建立体外循环（cardiopulmonary bypass,CPB）：左侧第四肋间开胸，降主动脉缝双荷包线，插入16G套管针监测动脉压。在其近端主动脉弓部缝双荷包线，插入18F动脉灌注管。经左胸腔打开心包显露右心房，插入32号腔静脉管。血气管理为α稳态管理。左心耳插入引流管。CPB前予肝素300U/kg。测ACT时间 400秒时开始并行降温30 min，CPB流量：75～90 ml/（kg·min），平均动脉压维持在50～70 mmHg，至直肠温20℃；全身停循环60 min，停呼吸机，主动脉不阻断；恢复循环10 min还氧债后开始复温，共辅助循环120 min，如有室颤给予除颤。复温时变温水箱的温度设定不高于40℃。
1.4 微透析方法
1.4.1 微透析针的固定 实验动物右侧卧位，暴露腰2、3段棘突，剪去腰2棘突，行腰2段椎板切除术，暴露腰2段脊髓背静脉，并紧贴脊髓背静脉的外侧以45度角向尾方向将探头插入脊髓背角，使透析膜全没入在脊髓背角内。采用2 mm膜长、0.25 μm 膜的CMA12微透析针。将微透析针小心地刺入脊髓灰质中，固定后开始透析灌流［2］。
1.4.2 透析方法 微透析针固定完成后，开始以2 μl/min的速度持续灌流人工脑脊液（复方氯化钠溶液）。平衡60 min，期间完成实验动物开胸，建立CPB的准备工作。之后开始连续采集微透析液的样品。每间隔30 min更换采样收集管。分为CPB前、降温30 min、停循环前30 min、停循环60 min、复温30 min、60 min、90 min和复温120 min几个时间点。实验过程中标本置于0℃冰壶中保存，每例实验完成后标本置于-86℃冰箱保存。
1.4.3 数据检测 微透析样本分别送中国林业科学院运用高效液相氨基酸分析仪和天津市环湖医院神经外科研究所通过CMA600自动化检测仪做氨基酸和能量代谢物质的含量检测。取每例试验动物的体外循环前样本的平均值为基数，计算各个实验动物在不同阶段的测量值与基数的比，这样可以避免动物个体和透析针回收率差异导致的统计误差。
1.5统计方法 应用SPSS 13.0统计软件（SPSS Inc, Chicago, IL）进行资料的统计学处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，均数比较采取多因素方差分析， P 0.05为有显著性差异，P 0.01为有非常显著性差异。所有计量数据检验前均经方差齐性和正态性分布检验。
2 结 果
2.1 能量代谢物质 葡萄糖、甘油和乳酸在降温和停循环期间无明显降低，复温后明显升高。丙酮酸在停循环后明显降低，复温后升高。乳酸/丙酮酸比值在停循环60 min时达高峰。见图1。
2.1.1 葡萄糖 停循环期间与CPB前比较无显著性差异。复温60 min含量高于停循环60 min（P=0.05），到复温120 min时较CPB前明显升高（P 0.05）。即在降温、停循环期间含量稍有降低，复温后明显升高。见图1。
2.1.2 甘油 在降温和停循环期间无显著性变化，复温后逐渐增高。复温60 min时含量达到最高峰，与之前的各时间点比较均有显著性差异。复温120 min时与降温30 min、停循环30 min和停循环 60 min比较仍有显著性差异（P 0.05）。即在降温、停循环期间含量稍有降低，复温后升高，在复温的60 min达到高峰，后稍有降低。见图1。
2.1.3 乳酸 降温和停循环期间无显著性变化，复温后增高。复温的60 min时达到最高峰，与其之前的各时间点比较均有显著性差异（P 0.05）。复温120 min时与降温30 min、停循环 30 min和复温60 min比较仍有显著性差异（P 0.05）。见图1。
2.1.4 丙酮酸 降温和停循环中含量逐渐降低，停循环 60 min时达到最低点（P=0.036）。复温后逐渐升高，60 min时达到最高峰，与之前各时间点和复温120 min比较均有显著性差异（P 0.05）。复温120 min时含量较降温和停循环时高（P 0.05）。见图1。
2.1.5 乳酸/丙酮酸比值 停循环后迅速升高，在停循环60 min时达到高峰，较CPB前升高5.8倍，复温后迅速下降。停循环60 min与其它时间点比较均有显著性差异（P 0.05）。见图1。
图1 能量代谢相关物质的变化趋势
（glucose葡萄糖；lac乳酸；glyc甘油；pyr丙酮酸；lacpyr乳酸/丙酮酸比值）
2.2 氨基酸 天门冬氨酸、甘氨酸和牛磺酸在复温时升高明显。谷氨酸和γ-氨基丁酸在降温时达到最高峰。见图2。
2.2.1 天门冬氨酸 在降温、停循环中有所升高，未达到显著性差异。复温120 min时升高明显，与CPB前、停循环60 min和复温30 min比较有显著性差异（P 0.05）。见图2。
2.2.2 谷氨酸 降温30 min达到最高峰，除与复温60 min比较无显著性差异外，与其它时间点比较均有显著性差异（P 0.05）。见图2。
2.2.3 甘氨酸 在降温和停循环中含量稍有升高，但是无统计学意义。与降温前比较分别在复温30 min和复温120 min时出现显著性升高（P=0.045，0.016）。复温60 min和90 min与复温的30 min和120 min比较，稍有降低，但无统计学意义。见图2。
2.2.4 γ-氨基丁酸（GABG） 与谷氨酸的变化趋势近似。降温30 min的含量高于降温前、复温30和90 min（P 0.05）。见图2。
2.2.5 牛磺酸 降温、停循环和复温的初期无显著性变化。复温120 min时显著升高达5.49倍，较其它时间点均有显著性差异（P 0.05）。见图2。
图2 氨基酸的变化趋势
（asp天门冬氨酸；glu谷氨酸；gly甘氨酸；gaba γ-氨基丁酸；tau牛磺酸）
2.3 病理学结果 标本采集完成后处死实验动物，完整取出腰2段脊髓，置入10%中性甲醛溶液中固定。送我院病理科横断面制作成组织切片后，行Harris苏木素─伊红染色法（HE染色）。神经元细胞数量大致正常，见图3；前角运动神经元轮廓清楚, 多极形, 细胞核大多位于中央, 核仁清晰可见，见图4； 尼氏体呈网斑状均匀排列于核周，见图5； 胞浆均匀, 深染。偶见出血灶，见图6。病理学结果：深低温停循环后脊髓损伤程度较轻。
3 讨 论
常用于深低温体外循环模型的有猴、犬、猪、兔等,与其他动物相比猪有着更多的优越性,来源方便，成本较低，猪的解剖结构较其他哺乳类动物更接近于人类，因此, 猪是研究脊髓缺血和深低温神经系统保护的理想模型［3-4］。微透析技术可以连续实时的观察和研究细胞间液中各种生化物质的变化，配合先进的检测仪器可以在分子水平研究细胞的各种状态。DHCA是主动脉手术中神经系统保护的重要方法。本研究发现深低温停循环后脊髓损伤程度较轻。目前国内外尚无脊髓神经元细胞在深低温停循环前后，能量代谢状态和氨基酸递质变化规律的研究报道。本研究旨在弥补国内外相关领域的研究空白，利用微透析技术实时观察脊髓神经元细胞在CPB降温、停循环和复温期间代谢相关物质和氨基酸的变化规律，进而探讨脊髓的代谢状况，研究其损伤的机制，为更好的保护脊髓提供理论依据。
我们研究深低温停循环前后的能量代谢产物变化发现，降温过程中能量相关物质无明显变化。停循环期间葡萄糖和乳酸无变化，丙酮酸显著下降。葡萄糖经一系列的磷酸化后生成丙酮酸，乳酸是丙酮酸在无氧的条件下接受H+后的产物。丙酮酸是糖的有氧氧化和无氧酵解的中间产物。乳酸/丙酮酸的比值（lactate/pyruvate ratio, LPR）可以反映细胞氧合状态［5］，高代谢状态时乳酸和丙酮酸同时升高，比值无明显变化。而缺血缺氧时乳酸升高、丙酮酸降低，LPR明显升高，故它较乳酸更能反映组织缺血。研究发现乳酸/丙酮酸的比值在停循环60 min显著升高，与停循环期间的缺血缺氧有关。
复温的过程中葡萄糖、乳酸、丙酮酸均出现升高，LPR无明显变化。在恢复血液循环后，丙酮酸和乳酸的增多，两者比值无变化，提示脊髓神经元细胞的代谢率明显提高。葡萄糖的含量较CPB前显著升高，提示细胞对其的利用仍低于正常水平。有研究表明［6］在严重的缺血后，神经元细胞更倾向于利用乳酸，而不是葡萄糖来获取急需的能量，进而导致葡萄糖的利用降低在局部堆积。高糖的微环境可以加重神经细胞的损伤［7］。乳酸的堆积可能引起局部组织的酸中毒，导致损伤的加重。甘油是细胞膜的组成部分，细胞间液中甘油的浓度变化反映细胞膜损伤的程度［8］，复温阶段含量升高也提示细胞损伤明显。
大量研究认为中枢神经系统受损后过度增高的兴奋性氨基酸在脑和脊髓继发性损伤中起着重要的作用［9］。CPB和深低温停循环对兴奋性氨基酸的影响尚存在较多争议。多数学者认为低温可以抑制兴奋性氨基酸的释放，直接推迟谷氨酸释放总的时间，直接减慢谷氨酸的释放速率［10］。本研究发现降温后天门冬氨酸和甘氨酸无明显升高，谷氨酸含量明显增加，原因可能为：① CPB对脑和脊髓灌注不充分，并影响血管的舒缩状态造成组织的缺血和缺氧；② CPB产生的大量微栓导致的小血管阻塞从而导致“微灶性”的缺血；③ 系统炎症反应对血脑屏障的破坏和对神经组织的损伤等。在停循环期间Glu和Asp均无显著性升高，说明深低温可以抑制兴奋性氨基酸的释放，进而减轻其对细胞的损伤。
本研究发现在复温的过程中除谷氨酸的升高不显著外，其它的兴奋性和抑制性、损伤性和保护性氨基酸均有增加。停循环后恢复灌注后存在诸多可能影响兴奋性氨基酸释放的原因，这部分与单纯CPB不同的改变包括：① 细胞代谢率的快速升高与细胞酸碱平衡环境的突然变化，以及血管舒缩状态的改变；② 突然接受CPB中带来的大量微栓，导致脊髓组织短期内大量“微灶性”缺血；③ 突然接受CPB带来的大量炎性刺激因素如白细胞黏附和游走，大量炎性介质；④ 脑细胞在恢复氧供时大量出现的氧自由基；⑤血管灌注压力的突然增加，脊髓血流量骤增可以导致血脑屏障开放，使神经元组织能够接受CPB的炎性因素刺激和神经细胞代谢功能的改变。
GABA和牛磺酸的升高是神经细胞在缺血损伤后的自我保护机制。神经细胞外液中的GABA是神经元和胶质细胞释放和摄取以及向脑脊液中扩散后的结果，也是GABA作为神经递质作用于突触后膜上的真实浓度，具有重要的生物学意义。中枢神经系统内GABA主要由谷氨酸脱羧而成。本研究发现谷氨酸和GABA间的变化有密切的联系，均在降温时显著升高，与以往研究的结果相同［11］。GABA可以作用于突触前受体，降低谷氨酸的释放，阻断Glu的兴奋毒效应，增加脑血流，降低脑代谢［11］。许多脑研究发现牛磺酸在脑缺血缺氧中能拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性、具有调节Ca2 +稳态的作用，可以减少一氧化氮 (NO)和自由基产生、抗脂质过氧化、降低细胞水肿和缺血细胞凋亡的发生及影响缺氧诱导因子的表达 ,对脑和脊髓的缺血再灌注神经元损伤具有保护作用［12］。牛磺酸可以拮抗谷氨酸的兴奋性毒性，防止谷氨酸由兴奋性向神经毒性水平转化［13］。复温阶段保护性氨基酸的显著升高说明此阶段脊髓神经元细胞的损伤最重。
总上所述，本研究发现：在实验动物降温过程中能量代谢相关物质无显著变化，而谷氨酸和GABA明显升高，说明低温体外循环期间脊髓神经细胞的能量代谢未受影响，但是炎性介质可能导致兴奋性氨基酸的释放。停循环期间脊髓神经细胞处于缺血缺氧的微环境中，但是各种兴奋性和抑制性氨基酸均无明显变化。复温过程中，高糖、高乳酸、高甘油的微环境；细胞处于高代谢状态；兴奋性和抑制性氨基酸升高，均提示脊髓神经细胞有剧烈的生化改变。由此可以推测深低温停循环导致的细胞损伤主要发生在复温阶段。控制性复温以及准确掌握神经系统保护药物的应用时限可以减轻神经细胞的损伤。
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