内容
作者：孙仁波 , 顾卫东 ,王耀华 ,张海洲 ,范全心 作者单位：1.四川达州市中心医院麻醉科, 四川 达州 635000; 2.上海闵行区中心医院麻醉科,上海 201100; 3.山东省立医院心外科,山东 济南 250021
【摘要】 目的 研究低温对脑缺血再灌注期间海马ATP和羟自由基（OH·）含量的影响，并探讨二者的变化与延迟性神经元死亡的关系。方法 沙土鼠前脑缺血再灌注模型，缺血时间10min。随机将动物分为假手术组、常温组和低温组，后两组又分为再灌注6 h、48 h、96 h三个亚组。每组13只动物，其中5只用于海马组织形态学观察，另8只用于ATP、ADP、AMP和OH·含量测定。ATP、ADP、AMP含量测定采用高效液相紫外检测器法，采用水杨酸捕捉法结合高效液相及电化学检测器法测定OH·含量。结果 再灌注96h，常温组海马CA1区存活锥体细胞数目仅为假手术组的5%（P 0.01），而低温组为假手术组的45%，明显多于常温组(P 0.01)。常温组各再灌注时间点海马ATP含量和腺苷酸池（ATP+ADP+AMP）含量均明显低于假手术组(P 0.01)。除再灌注6 h外，低温组海马ATP和腺苷酸池含量均明显高于常温组(P 0.05)。常温组再灌注6 h，海马2,3-DHBA含量明显高于假手术组和低温组(P 0.01或 P 0.05)，但再灌注48 h和96 h，三组间海马2,3-DHBA含量已无显著性差异。结论 延迟性神经元死亡主要与脑缺血后持续的细胞能量代谢障碍有关，而低温可通过减轻细胞能量代谢障碍，起到减少延迟性神经元死亡的作用。
【关键词】 脑缺血；再灌注；海马；ATP；羟自由基
Effect of Hypothermia on ATP and Hydroxyl Radical Levels in
Hippocampus during Cerebral Ischemia/Reperfusion
SUN Ren-bo1,GU Wei-dong2,WANG Yao-hua1,ZHANG Hai-zhou3,FAN Quan-xin3
( 1.Department of Anaesthesia the Centre Hospital of Dazhou City,Sichuan,635000;
2.Department of Anaesthesia the Centre Hospital of Minxing District, Shanghai,201100;
3.Department of Thoracic Surgery the Hospital of Shandong Province, Shandong,250021,China)
Abstract: OBJECTIVE To study the effect of hypothermia on ATP and hydroxyl radical levels in hippocampus during cerebral ischemia/reperfusion, and investigate the relationship between the change of their content and delayed neuronal death. METHODS Forebrain ischemia in gerbils was produced by occlusion of bilateral common carotid arteries using aneurysm clamps, and the insult time was 10 min. Gerbils were randomly divided into sham-operated group, normothermia group and hypothermia group. Both normothermia group and hypothermia group were further divided into 3 subgroups according to the reperfusion time (6 h, 48 h and 96 h). The brain temperature in all gerbils during cerebral ischemia was kept at 38±0.2℃, and it was kept at 30±0.2℃ within 6 h of reperfusion in hypothermia group. However, the brain temperature in normothermia group was kept at 38±0.2℃. The number of surviving neurons in hippocmpal CA1 sector in 100 μm2 was counted (n=5). ATP, ADP, AMP and hydroxyl radical levels were determined by high liquid chromatography (n=8). RESULTS The number of surviving neurons in hippocampal CA1 sector after reperfusion 96 h in normothermia group was only 5±2/100 μm2, much less than that in sham-operated group (96±12/100 μm2)(P 0.01). The number of surviving neurons in hippocampal CA1 sector after reperfusion 96 h in hypothermia group was 45±13/100 μm2, much more than that in normothermia group (P 0.01). ATP and adenine nucleotide pool levels in hippocampus in normothermia group significantly decreased after reperfusion (P 0.01). ATP and adenine nucleotide pool levels in hippocampus in hypothermia group were much more than that in normothermia group after reperfusion 48 h and 96 h (P 0.05). The 2,3-DHBA outputs after reperfusion 6 h in normothermia group increased by 132% of that in sham-operated group (P 0.01), but there was no significant difference of 2,3-DHBA outputs between normothermia group and sham-operated group after reperfusion 48 h and 96 h. There was also no significant difference of 2,3-TDHBA outputs between hypothermia group and sham-operated group. The 2,3-DHBA outputs after reperfusion 6 h in hypothermia group was much lower than that in normothermia group (P 0.05). CONCLUSION The persist failure of energy metabolism could lead to the delayed neuronal death after cerebral ischemia. Hypothermia could prevent delayed neuronal death by attenuating the persist failure of energy metabolism.
Key words： Cerebral ischemia;Reperfusion; Hippocampus;ATP;Hydroxyl radical
低温减轻脑缺血再灌注损伤的作用在动物实验和临床实践中均已得到证实［1-3］。研究发现［4-5］，沙土鼠脑缺血10 min后持续低温6h可明显减少海马CA1区的延迟性神经元死亡（delayed neuronal death, DND），但其机制仍不清楚。本课题拟通过观察低温对脑缺血再灌注期间海马CA1区锥体细胞ATP含量和羟自由基（OH·）生成的影响，以进一步阐明低温减轻脑缺血再灌注损伤的机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型制备 沙土鼠前脑缺血再灌注模型［6］。沙土鼠由徐州医学院动物实验中心提供，体重50～70 g，雌雄不拘。用戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，将动物俯卧于实验台上，自头顶部切开皮肤，于矢状缝外2 mm，前囟后2 mm处，用细钻钻洞（不钻透脑膜），置入自制电极，用牙托粉固定。电极接多功能脑电监护仪监测脑电图，以判断沙土鼠是否造成脑缺血。而后将动物仰卧于实验台上，正中切开颈部皮肤，仔细分离双侧颈总动脉，用无创动脉夹阻断颈总动脉血流造成脑缺血，松开动脉夹恢复脑血流即为再灌注。脑缺血时间10 min，缺血期间脑温维持在（38±0.2）℃。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不予阻断。
1.2 实验分组 随机将动物分为假手术组、常温组和低温组，后两组又分为再灌注6 h、48 h、96 h 3个亚组。共7组，每组13只动物。其中5只用于海马组织形态学检查，另8只测定ATP、ADP、AMP和OH·含量。因DND主要发生在再灌注48 h后，故再灌注6 h未行海马组织形态学检查。
1.3 脑温的测定和控制 鼓膜温度与脑温最为接近，故本实验监测鼓膜温度以反映脑温。实验时将漂浮导管头端的热敏电阻剥出，插入沙土鼠耳内监测鼓膜温度。为便于温度控制，将动物置于空气浴箱中，应用灯泡加热或冰块降温的方法维持沙土鼠脑温于预定温度。低温组恢复再灌注后迅速将脑温降至（30±0.2）℃，维持6 h后复温至（38±0.2）℃；常温组再灌注6h内控制脑温在（38±0.2）℃。两组动物再灌注6h后均置于常温下再灌注。脑温控制期间通过间断腹腔注射戊巴比妥钠维持麻醉，记录各组戊巴比妥钠的用量。
1.4 组织形态学检查 假手术组于术后即刻、常温组和低温组分别于再灌注6 h、48 h、96 h动物再次经戊巴比妥钠麻醉，开胸，经主动脉插管灌注生理盐水60 mL，继以4%多聚甲醛100 mL， 然后断头取脑， 4%多聚甲醛浸泡固定，在海马齿状回互包平面作石蜡切片，厚5 μm。 低倍镜(4×10)观察海马CA1区锥体细胞带的厚度，高倍镜(40×10)计数海马CA1区内细胞膜和核膜完整，核仁清楚的存活锥体细胞数目。
1.5 海马组织ATP、ADP、AMP和OH·含量的测定
1.5.1 海马组织标本的采集和处理 动物断头处死前30 min腹腔注射水杨酸钠100 mg/kg以捕捉OH·。各组动物在相应时间点断头处死，在生理盐水冰面上迅速分取海马，液氮冷冻，-75℃保存。一侧海马测定OH·含量，另一侧测定ATP等含量。
1.5.2 海马组织ATP、ADP、AMP含量的测定 采用高效液相紫外检测器法。海马组织称重，加冷的0.4 mmol/L高氯酸制成10%匀浆，15 000×g，离心15 min。取上清液0.3 ml加入3 mol/L的K2CO3 0.03 ml调节pH至中性，4℃，3 000 r/min离心5 min，取上清液50 μl进样。高效液相条件：色谱柱ODS-C18；流动相：0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0），流速1 ml/min。紫外检测器波长254 nm。
1.5.3 海马组织OH·含量的测定 海马组织称重后以1：5（W/V）加入10%三氯乙酸，在冰浴下用超声波匀浆器制成匀浆，4℃，9000×g离心15 min。上清液50 μl注入高效液相测定2，3-DHBA的含量。色谱柱为15 cm×4 μm Lichrosorb-RP18，L-ECD-6A型电化学检测器，氧化电位+0.75 mv。流动相：0.03 mol/L柠檬酸、0.03 mol/L醋酸钠、10%甲醇缓冲液，pH 3.6，流速1 ml/min 。
1.6 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用成组设计t 检验，P 0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 戊巴比妥钠用量 常温组和低温组戊巴比妥钠用量分别为(72±23)mg/kg和（76±16）mg/kg，两组间无显著性差异。
2.2 海马CA1区组织形态学改变和存活锥体神经元数目 再灌注48 h常温组和低温组海马CA1区存活锥体细胞数目与假手术组相比均无显著差异。但再灌注96 h时，常温组海马CA1区存活锥体细胞数目仅为假手术组的5%（P 0.01），低温组为假手术组的47%，明显多于常温组（P 0.01），但少于假手术组（P 0.01）见表1。表1 海马CA1区存活锥体细胞数目（注： 与假手术组比^P 0.01;与常温组比 #P 0.01
2.3 海马组织ATP和腺苷酸池（ATP+ADP+AMP）含量的变化 常温组再灌注6 h、48 h、96 h，海马组织ATP和腺苷酸池含量明显降低，ATP含量分别为假手术组的79%、73%和66%（P 0.01），腺苷酸池含量为假手术组的76%、71%和61%（P 0.01）。除再灌注6 h外，低温组ATP和腺苷酸池含量均明显高于常温组（P 0.05）。见表2。
2.4 海马组织2，3-DHBA含量的变化 常温组再灌注6 h，海马2，3-DHBA含量增高至假手术组的132%（P 0.01），但再灌注48 h和96 h海马2，3-DHBA含量与假手术组相比已无显著性差异。低温组所有时间点海马2,3-DHBA含量与假手术组比较均无显著性差异，且低温组再灌注6 h时海马2,3-DHBA含量明显低于常温组(P 0.05)。见表2。
3 讨 论
以往的文献中，沙土鼠常温脑缺血模型脑温多控制在37℃～37.5℃［7］，本实验测定了50只正常清醒沙土鼠的脑温，发现正常沙土鼠脑温的95%可信区间为（37.9±1.1）℃。因此，本实验以38℃作为沙土鼠的正常脑温，沙土鼠脑缺血期间及常温再灌注6 h内脑温均控制在（38±0.2）℃。
巴比妥类麻醉药可降低脑缺血时脑组织的氧耗、减少钙内流及抑制自由基的生成，因而对脑缺血具有一定的保护作用。本实验脑温控制期间采用戊巴比妥钠维持麻醉，我们比较了常温组和低温组戊巴比妥的用量，发现两组间无明显差别，故可排除戊巴比妥钠对实验结果的影响。
不同的神经细胞对缺血的敏感性存在差异，海马CA1区锥体细胞对脑缺血最为敏感［8］。因此，我们选择海马CA1区锥体细胞作为研究对象。实验发现，沙土鼠脑缺血10 min常温再灌注48 h海马CA1区无明显的锥体细胞死亡，而常温再灌注96 h海马CA1区出现了大量的锥体细胞死亡，且低温组表2 脑缺血再灌注期间海马ATP、腺苷酸池、2,3-DHBA的含量的变化注：与假手术组比 ^P 0.01; 与常温组比 #P 0.05
低温再灌6 h后复温至38℃，延续再灌注96 h时海马CA1区存活锥体细胞数目明显多于常温组。上述结果表明DND的发生主要在脑缺血48 h之后，低温再灌注则可明显减少DND的发生，这与大多数文献报道的结果一致［9-10］。但本实验中，常温组再灌注96 h海马CA1区存活锥体细胞数目为5%，少于Edward等［11］报道的20%。其可能原因有：① 脑缺血时间不同，本实验脑缺血时间为10 min，而Edward等采用的脑缺血时间为5 min。② 脑温不同，本实验脑缺血期间及再灌注6 h内，脑温控制在（38±0.2）℃，而Edward等采用的脑温为37℃。
OH·可攻击蛋白质、核酸和生物膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，引起细胞代谢、功能障碍，最终导致细胞死亡。因此，以往的研究认为OH·生成是脑缺血再灌注损伤的重要原因。本实验室前一阶段的研究发现［12］，沙土鼠常温脑缺血再灌注1h海马OH·含量明显增加。本实验中，常温组再灌注6 h海马OH·含量也明显多于假手术组，这与大多数文献报道的结果一致［13-14］。但本实验进一步发现，常温组再灌注48 h海马OH·含量已恢复至正常水平，并且再灌注96 h海马OH·也无明显升高，而此时病理检查发现，海马CA1区已有大量的锥体细胞死亡。上述现象说明，OH·的损伤作用主要发生在再灌注早期，而再灌注后期其含量已基本恢复正常。实验还发现，低温可减少再灌注早期OH·的生成，低温组再灌注6 h海马OH·含量较常温组下降了20%（P 0.05），这可能是低温减少DND的机制之一。
ATP是细胞代谢的主要能量来源，脑缺血后细胞功能的恢复有赖于充足的能量供应，如果细胞能量代谢障碍持续存在则必然导致细胞死亡。Homola等报道［15］，未成年大鼠单侧脑缺血3 h常温再灌注4 h、12 h、72 h时，损伤侧脑组织ATP含量仅为对侧正常组织的79%、65%和62%，同时腺苷酸池含量也明显降低，且ATP和腺苷酸池含量与脑组织含水量成反比。本实验发现沙土鼠脑缺血10 min，常温组再灌注后海马ATP含量6 h为78%，48 h为73%，96 h为66%，同时腺苷酸池含量也明显降低，至再灌注96 h时海马ATP和腺苷酸池含量下降了50%左右，其变化与病理检查的结果相吻合。因此，脑缺血后细胞持续性的能量代谢障碍可能为DND的重要原因。本实验进一步发现，低温组再灌注48 h和96 h时，海马ATP和腺苷酸池含量明显高于常温组，且低温组再灌注96 h时海马CA1区存活锥体细胞数目也明显多于常温组。这一结果提示，低温减轻DND的机制可能与其减轻脑缺血再灌注期间细胞能量代谢障碍有关。
综上所述，低温一方面可减少再灌注早期OH·的生成，另一方面可减轻再灌注期间持续的细胞能量代谢障碍，从而起到减轻DND的作用。
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