内容
作者：汪进益，范慧敏，张旭敏，卢 蓉，李 健，刘中民 作者单位：同济大学附属东方医院心胸外科，上海 200120
【摘要】 目的 探讨经体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)后人体炎性血浆对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)的钙池操纵的钙通道电流(store-operated Ca2+ currents, Isoc)的影响。方法 CPB后血浆采自我科心血管外科手术患者，患者均知情同意。将已培养好的HUVECs按所加入的血浆不同分为4组，每组6例：即组Ⅰ (加入CPB刚开始0 min时血浆的对照组)、组Ⅱ (加入CPB后25 min的血浆)、组Ⅲ(加入CPB后50 min的血浆)及组Ⅳ(加入CPB后50 min含左旋精氨酸的血浆)。应用全细胞膜片钳记录技术测定并观察各组HUVECs的Isoc变化。结果 在HUVECs上可记录到Isoc；当钳制电位为-100mV时，组Ⅰ～组Ⅳ中HUVECs的Isoc分别为(-302.38±35.13) pA、(-388.59±58.66) pA、(-577.04±93.69) pA及(-365.42±34.79) pA，各组比较差异有统计学意义(P 0.05或P 0.01)，其中组Ⅳ明显低于组Ⅲ(P 0.01)。结论 CPB后人体炎性血浆可增强血管内皮细胞的钙通道电流，左旋精氨酸可减轻此作用，这对于进一步深入研究CPB围术期血管内皮细胞钙超载的发生机制和防治具有重要意义。
【关键词】 体外循环; 血管内皮细胞; 钙池操纵的钙通道电流; 膜片钳技术
The Effects of Plasma from Cardiopulmonary Bypass on
Store-Operated Ca2+ Channels Currents in
Human Umbilical Vein Endothelial Cell in Vitro
WANG Jin-yi, FAN Hui-min, ZHANG Xu-min, LU-Rong, LI-Jian, LIU Zhong-min
( Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery of
East Hospital Affiliated Tongji University, Shanghai 200120, China)
Abstract: OBJECTIVE To observe the effect of inflammatory plasma on store-operated Ca2+ currents (Isoc) of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cultured in vitro after cardiopulmonary bypass (CPB) in cardiovascular surgery. METHODS The plasma was collected from patients of Department of Cardiac Surgery, Shanghai East Hospital Affiliated Tongji University. The patients all knew the program and agreed with. The randomly selected HUVECs were divided into four groups with same culture condition: GroupⅠ (control group adding the plasma after 0 min CPB), GroupⅡ (adding the plasma after 25 min CPB), Group Ⅲ (adding the plasma after 50 min CPB) and Group Ⅳ (adding the plasma with L-arginine after 50 min CPB). The Isoc of HUVECs in each group was determined by whole cell patch-clamp techniques. RESULTS The dynamic changes of the Isoc of the single HUVECs was determined by tight-seal whole-cell patch-clamp techniques. At the potential of -100 mV, the peak amplitude of Isoc of HUVECs were (-302.38±35.13) pA, (-388.59±58.66) pA, -(577.04±93.69) pA and (-365.42±34.79) pA, respectively in these groups. The Isoc was significantly lower in the control group than in other groups (P 0.05 or P 0.01). It was distinctly lower in the Group Ⅲ than in the Group Ⅳ (P 0.01). CONCLUSION The injury and activation of vascular endothelial cells can be widely induced by CPB which could markedly potentiate the peak amplitude of Isoc in a dose-dependent manner, but L-arginine can attenuate this process.
Key words： Cardiopulmonary bypass;Vascular endothelial cells;Store-operated Ca2+ currents;Patch-clamp techniques
血管保护是体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)过程中的一个重要组成部分，近年来的研究表明，血管内皮细胞不只是血液与间质组织间的屏障，还具有接受和传递信息以及内分泌功能［1］。Ca2+ 作为细胞内第二信使，在维持细胞代谢、增值、分裂和凋亡、Ca2+ 依赖蛋白激酶和磷脂酶的激活、胞外分泌及基因调控等多种过程中具有重要的作用。血管内皮细胞等非可兴奋细胞内Ca2+ 浓度维系的主要途径是钙池操纵的Ca2+ 通道(store-operated calcium channels，SOC)，即Ca2+ 内流是通过细胞内兴奋剂敏感性钙池中Ca2+ 浓度调节的［2-5］。本实验采用人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)培养的方法，应用膜片钳技术研究CPB后炎性血浆对HUVECs胞膜上SOC电流(store-operated Ca2+ currents, Isoc)的影响，以进一步丰富CPB中有关血管保护研究的电生理特性及病理生理的机制理论。
1 材料与方法
1.1 实验材料 CPB血浆采自我科心血管外科手术患者，胎儿脐带取自我院产科，患者均知情同意。DMEM培养基、胎牛血清(GIBCO)；混合胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Ⅷ因子单克隆抗体、SABC试剂盒(武汉博士德公司)；Egtazic acid (AMERSCO)，谷氨酸钾、Mg-ATP(Sigma)。玻璃电极(Would Precision, USA)，Axopatch 200B膜片钳放大器(AXON INSTRUMENTS,USA)，MP-285三维微操纵器和MODELP-97微电极拉制器(SUTTER INSTRUMENT Co., USA)，Zeiss Axiovert 200倒置显微镜(ZEISS, USA)，H6024-240微电极抛光仪(WPI, INC Sarasota, Fl, USA)，RSC-200快速加药灌流装置(Biologic Science Instruments, USA)。
1.2 实验方法
1.2.1 CPB患者血浆的采取 选择施行CPB下心血管外科手术患者24例，心功能Ⅲ～Ⅳ级，选择标准：未使用过影响凝血机制的药物、无明显的凝血系统疾病史、无肝肾功能不全史、无风湿活动以及CPB时间大于60 min者。在无菌操作条件下，分别于CPB刚开始(0 min)、25 min和50 min取体外循环机储血器内血液10 ml，无菌条件下离心(1000 r/min) 10 min后将血浆保存在-70℃冰箱中。实验时取出注入RSC-200快速加药灌流装置的各加药管内进行干预性实验。
1.2.2 HUVECs的体外原代培养 按照李菊香等［6］采用的改良Jaffe方法［7］，无菌条件下取胎儿脐带20～40 cm，用Hanks液洗净脐静脉内的血液后，夹住脐带两端并注入0.1%胶原酶，37℃下消化5 min，收集消化液，并用DMEM培养液冲洗脐静脉，将冲洗液与消化液一起经1000 rpm离心10 min以沉淀细胞，之后用Hanks液清洗一遍细胞，弃上清液，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液混匀，放入培养瓶，在37℃、5% CO2 孵育箱内静置培养。每两天换一次液，原代细胞长至80%融合时，Ⅷ因子免疫组化染色鉴定后传代培养。选取培养3代细胞，计数调整细胞密度后进行分组实验。
1.2.3 实验分组 随机分为4组，每组6例：组Ⅰ(对照组)：加入CPB刚开始0 min时的血浆；组Ⅱ：加入CPB后25 min的血浆；组Ⅲ：加入CPB后50 min的血浆；组Ⅳ：加入CPB后50 min含有左旋精氨酸(L-arginine, L-arg)的血浆。
1.2.4 CPB患者血浆对HUVECs胞膜上Isoc的影响 实验时使用传代于第3代的HUVECs，按2.0～4.0×104 细胞浓度传于35 mm×10 mm培养皿内，静置培养4～6 h后，换为标准细胞外液(NaCl 140.0 mmol/L、KCl 2.8 mmol/L、CaCl2 10.0 mmol/L、 MgCl2 0.5 mmol/L、Glucose 11.0 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L，用1N NaOH调定pH至7.4)。选用阻抗为2.0～5.0 MΩ的电极，其内灌注电极内液(K-glutamate 145.0 mmol/L、NaCl 8.0 mmol/L、MgCl2 1.0 mmol/L、Mg-ATP 0.5 mmol/L、Egtazic acid 10.0 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L， 用1N KOH调定pH至7.2)。显微镜下通过MP-285三维微操纵器将微电极靠近细胞，当电极尖端与细胞表面形成1～3 GΩ的高阻封接电阻时，给电极内施加适当的负压形成全细胞记录式状态。利用RSC-200快速加药灌流装置将对照及实验各组CPB患者血浆加至同一HUVECs细胞周围，加药管口距细胞约100 μm，每次更换药物浓度作用约25～28 s，应用pClamp 9.0软件在预先设置钳制电位方案［8-11］的条件下动态采样记录原始电流，所有观察指标在同一细胞完成。
1.3 统计学分析 采用SAS 6.12软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示；多个样本均数间比较差异性用多个样本均数比较的方差分析，各实验组和对照组的比较采用多个样本均数间的两两比较（Dunnett-t检验），检验标准设为a=0.05或者0.01。
2 结 果
2.1 HUVECs的原代培养和鉴定 HUVECs在原代培养1 d后，可以见到细胞均贴壁伸展，成片生长，呈短梭形、短圆形或多角形，长多角形不规则细胞突起，细胞之间紧密衔接，连接成片，7～8 d后呈铺路石样；Ⅷ因子免疫组化染色阳性。
2.2 CPB患者血浆对HUVECs胞膜上Isoc的影响 HUVECs胞膜Isoc 全细胞膜片钳记录形成后，利用Ca2+电流钳制方案，即：钳制电位保持在0 mV时，各实验电位(TP)从－100 mV至＋80 mV连续刺激200 ms，刺激波宽20 mV，刺激频率为0.2 Hz，可记录到明显的Isoc，且该电流可稳定维持不少于5 min而未出现Rundown现象。按实验要求加各组血浆作用后可记录到随着血浆的不同而出现不同程度改变的电流。见图1（各组电流图正上方的矩形图为阶跃指令电位模式图。 A～D分别为组Ⅰ～组Ⅳ）。
当膜电位钳制于-100 mV时，对照组HUVECs胞膜Isoc 的峰值电流为(-287.37±23.03) pA；在CPB炎性血浆作用下，CPB后25 min血浆组、CPB后50 min血浆组及CPB后50 min含L-arg血浆组HUVECs胞膜Isoc 的峰值电流分别为(-302.38±35.13) pA、-(577.04±93.69) pA及(-388.59±58.66) pA，高于对照组(P 0.05或P 0.01)，说明CPB炎性血浆可以增强内皮细胞的Isoc；而添加了L-arg的CPB后50 min含L-arg血浆组明显低于CPB后50 min血浆组(P 0.01)，说明L-arg可抑制CPB炎性血浆诱导的内皮细胞Ca2+内流，抑制细胞内Ca2+超载，对血管内皮细胞具有保护作用。
3 讨 论
CPB是一个非生理性的体外氧合和循环过程，由于血液同CPB管道及氧合器等非生理表面的接触、外科手术创伤、术中温度的变化、血流方式改变、血液中各种血细胞成分的激活和组织缺血/再灌注损伤过程及其促发的某些继发性损伤因素导致血管内皮细胞的损伤，进而通过多个途径引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，导致全身器官功能障碍，严重者可导致全身器官功能衰竭，在这个过程中细胞因子等炎性因子的表达是十分重要的因素，并在一定程度上反映SIRS的严重程度［12］。血管内皮细胞不仅是调节血管通透性的屏障，而且还具有多种生物学功能。体外培养内皮细胞的生理功能与人体微循环内皮细胞的生理功能相似，易控制实验条件，可排除非特异因素的影响，因此可在实验中采用体外培养内皮细胞的方法进行研究［6］。近年来有学者发现Ca2+ 可以经由SOC进入细胞，通过多方面作用对炎性进行调控，进而活化T细胞产生免疫反应［13］。参与炎性和免疫反应的细胞多为非兴奋性细胞，SOC则是血管内皮细胞等非兴奋性细胞胞外Ca2+ 内流的主要通道，具有相对高的单通道电导和较严格的Ca2+ 选择性，可通过钙池的耗竭来激活Ca2+ 的内流，并参与基因转录、细胞凋亡、肌肉收缩、炎症和应激等多种生理和病理生理过程［14］。
细胞内Ca2+ 稳态(calcium homeostasis)的维持在细胞生理、生化过程中起着极为重要的作用，Ca2+ 不仅可直接激活具有多种生理功能的胞内机械活动，而且也可作为细胞信使介导胞外信号对胞内的反应。膜片钳记录技术(patch clamp recording technique)是近年来兴起的一种研究活细胞中包括Ca2+ 在内的各种离子浓度变化的新技术，利用该技术研究Ca2+ 超载(calcium overload)现象，不仅提示细胞激活时Ca2+ 的来源及贮存浓度，而且能说明SOC及其Ca2+ 再循环的本质。本研究采用CPB后血浆作用于体外培养的HUVECs，观察CPB后人体炎性血浆对血管内皮细胞Isoc的影响，应用全细胞膜片钳记录技术，在体外培养HUVECs上成功记录到Isoc，由于SOC是细胞外游离钙离子进入内皮细胞内的重要通道［2］，因而可以推测CPB后炎性血浆是通过影响内皮细胞的Isoc来调节细胞内的钙离子浓度。实验结果显示，对照组HUVECs胞膜Isoc 的峰值电流低于各实验组，而CPB后50 min血浆组又明显高于CPB后25 min血浆组和CPB后50 min含L-arg血浆组，这说明在CPB过程中内皮细胞随着时间的延长损伤越来越重，使内皮细胞SOC激活，Ca2+ 内流增加导致细胞内Ca2+ 超载；而L-arg可抑制SOC的活性，这说明CPB对内皮细胞产生激活作用而L-arg能对抗这种作用，减轻CPB对内皮细胞的损伤。因此，经过CPB过程的血浆对内皮细胞的影响是一个从高度激活到损伤和功能降低的过程，提示CPB中采取有效措施减轻CPB对血管内皮细胞的损伤可减轻Ca2+ 超载，有助于CPB后患者的康复，对保护内皮细胞的功能具有现实的意义。
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